Диссертация (1140639), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Подсчет численности данных клеток проводили,используя лейкоцитарную формулу общего анализа крови. Фагоцитарнаяактивность моноцитов и нейтрофилов оценивалась с помощью анализа истинногофагоцитоза – фаготест и изучения продукции активных форм кислорода –фагобурст. Исследование производилось на проточном цитометре «coulter EpicsXL» (США). Количество иммуноглобулинов A, M, G в сыворотке кровиустанавливали с помощью радиальной иммунодиффузии в агаровой среде поМанчини в иммунологической лаборатории с использованием диагностическихмоноспецифических сывороток.Для оценки воспалительной реакции слизистой влагалища и цервикальногоканала и выделения микробной состоавляющей всем пациенткам производилосьбактериологическоеимикроскопическоеисследованиевагинальногоотделяемого.
Для микроскопического анализа забор материала осуществлялиурогенитальным зондом на предметные стекла из трех точек (уретра, задний сводвлагалища, цервикальный канал), далее использовались методики окраски по74Грамму и Романовскому-Гимзе. Образцы для бактериологического исследованиябрали стерильным тампоном и помещали в пробирку с транспортной средой(среда Эймса), после чего производили посев материала на общепринятые среды.ОпределениевозбудителейИППП(уреаплазма,микоплазма,хламидия,гарднерелла, цитомегаловирус, ВПГ 1,2 тип, ВПЧ) в содержимом цервикальногоканала выявляли методом ПЦР путем помещения исследуемого материала втранспортную среду типа Эппендорфф с последующей амплификацией идетекцией продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза.Для оценки состояние шейки макти проводилось онкоцитологическоеисследование соскобов с поверхности шейки матки по технологии жидкостнойцитологии и приготовления тонкослойных цитологических препаратов (Thin Prepметод).
Материал (соскоб из цервикального канала и с поверхности экзоцервикса)помещалсявособенныйстабилизирующийраствор(BDShurePath),обеспечивающий сохранность биоматериала. Взятие образцов производили путемсоскоба с поверхности влагалищной части шейки матки и из эндоцервиксаодноразовой цито-щеточкой (cervix-brush).
Для забора шейка тщательнопредварительно очищалась от слизи ватным тампоном. Материал вместе с щеткойпомещали в контейнер с жидкой транспортной средой. После чего средацентрифугировалась в режиме 1000 оборотов в течение 5 минут при среднемускорениинацентрифугеавтоматизированной(Cytospin-4).системойпросмотраГотовыйпрепаратцитологическихоценивалсяпрепаратов BDFocalPoint GS, затем просматривался цитологом.Дополнительные методы исследования.Для выявления трубно-перитониального и эндокринного бесплодия пациентамбыло произведено обследование.Для уточнения формы эндокринного бесплодия:- ультразвуковая фолликулометрия- магнитно-резонансная томография черепа с визуализацией турецкогоседла (при высоком уровне пролактина для исключения микроаденомы гипофиза)75-исследование уровня гормонов щитовидной железы и тиреотропногогормона, для исключения патологии (Т3, Т4)-глюкозотолерантный тест при подозрении на нарушения углеводногообмена.Для выявления трубно-перитонеального фактора бесплодия производиласьгистеросальпингография на 8-12 день менструального цикла или лапароскопия схромогидротубацией.Для исследования функционального слоя эндометрия всем пациенткамрекомендовалась пайпель-биопсия эндометрия с последующим цитологическимисследованием материала по технологии жидкостной цитологии и изготовлениятонкослойных цитологических препаратов (Thin Prep-метод).
При выявленииметодом ультразвуковой диагностики патологии эндометрия (гиперплазия,полипы эндометрия), рекомендовалось проведение гистероскопии и раздельногодиагностическоговыскабливанияисследованием материала.споследующимгистологическим762.3.Метод внутривлагалищной аутолимфоцитотерапии.Курс лечения методом влагалищной аутолимфоцитотерапии проходили всепациентки основной группы. Перед назначением ВАЛТ пациентки осматривалисьгинекологом и врачом-иммунологом.
Процедура включала в себя следующиеманипуляции:1. Забор периферической крови в объеме 10-20 мл производили у пациентокутром в вакуумные пробирки из локтевой вены. Далее с целью получениялейкоцитарной суспензии в 2 мл гепаринизированной крови добавляли 1 млподогретого до 37°C 3% раствора желатина и помещали в термостат на 30 мин(37°C). После проведенной процедуры слой плазмы с лейкоцитами помещался впластиковую пробирку, после чего отмывался с помощью фосфатно-солевогобуфера (10-ти кратный объем, рН=7,4).
Затем раствор лейкоцитов помещался вцентрифугу на 10 минут при 1000 об/мин, затем его разводили в растворе Хенксабез ионов Са2+ и Mg2+. В камере Горяева производили подсчет лимфоцитов(доводили до 106-107 кл/мл) и после окраски метиленовым синим проверяли ихжизнеспособность.2. Полученную суспензию клеток ресуспензировали в 0,9%-м растворехлорида натрия. Далее лимфоциты культивировали вместе с фармпрепаратом,обладающим иммуномодуляторными свойствами (в нашем случае 1,0-0,005%стерильным раствором имунофана) около 4-6 часов, при 37°C и влажности 95% ватмосфере, содержащей 5% CO2.Полученный раствор подтвергался двукратному отмыванию: первый раз - вRPMI 1640, второй раз - изотоническим раствором NaCl.Далее клеткиресуспензировали в 1 мл стерильного 0,9%-го раствора натрия хлорида.
Затемповторно осуществлялся подсчет клеток и оценка их жизнеспособности в камереГоряева. Все перечисленные манипуляции производились врачом лаборантомиммунологом.В Таблице 7 представлены данные, которые указывают на достаточновысокуюжизнеспособностьаутолимфоцитовкровипослеактивации77имунофаном.Каквидно,непосредственнопослеполучениясуспензиилимфоцитов жизнеспособность их колебалась от 90 до 97%, через несколькочасов после культивирования с имуномодулятором составила 80-90%, поистечении 6 часов - 81-77%, 48 часов - 50-60%.Таблица7–Изучение жизнеспособностилимфоцитов, выделенных изпериферической крови доноров, в процессе их инкубации с имунофаномДатаВремя инкубации (час)Жизнеспособность (%)Концентрациякл/мл × 10614-10-140976,73850,266810,6348750,520959,83810,26770,4548510,7714-10-143.НепосредственномедицинскаяпроцедураВАЛТпроводиласьвамбулаторных условиях врачом гинекологом на гинекологическом кресле.
Встерильных условиях с помощью зеркала Куско производили санацию влагалищаантисептическим раствором (octenisept в разведении 1:6, экспозиция 1 минута),далее слизистую оболочку осушали стерильным ватным тампоном. Посредствомшприца на 5 мл слизистую влагалища и шейки матки орошали суспензиейаутолимфоцитов, разведенных в 5,0 мл стерильного физиологического раствора.Процедуру начинали с введения 1×106 кл/мл клеток 1 раз в неделю,постепенно повышая до 1×106 кл/мл.
Время процедуры колебалось в пределах 4060 мин. Процедуру начинали за 2-3 месяца до процедуры ЭКО, проводилась скратностью в 1-2 раза в неделю, в количестве 6-10 процедур на курс [55].Далее пациентки проходили стандартную процедуру ЭКО и ПЭ (принеобходимости ИКСИ).782.4.Характеристика процедуры экстракорпорального оплодотворения ипереноса эмбрионаПротокол программы экстракорпорального оплодотворения проводился постандартной схеме с незначительными модификациями.Стимуляцию яичников проводили с учетом индивидуальных особенностей иданных анамнеза по «длинной» (с использованием агонистов ГнРГ) или«короткой» (без а-ГнРГ) схеме.Протокол стандартной схемы ЭКО:начало – 19-21 день циклабазовая терапиямониторингподавление функции гипофизастимуляция функции яичниковв течении 10-14 дней8-12 дней36 часовподдержка функции ЖТутрожестан\дюфастонагонисты-ГнРГ……………………………препараты ФСГ……………….….ХГЧ ………….забор ооцитов………..ПЭ …………………..1.
Подавление функции гипофиза агонистом ГнРГ (Бусерелин /ООО Фармсинтез, Россия/, Диферелин /Ipsen Pharma, Франция/, Люкрин-депо / AbbottLaboratories, Испания/) начинали на 19-21-й день цикла.2. Схема стимуляция функции яичников подбиралась индивидуально исоставила в среднем 8-12 дней. Стандартная стартовая доза гонадотропинасоставила 150-225 МЕ препарата в зависимости от возраста пациентки,анамнеза и т.д.
Применяемые гонадотропины: Пурегон (фоллитропин-бета)/Organon, Нидерланды/, Гонал-Ф (фоллитропин-альфа) /Serono EuropеLtd.,Великобритания/, Менопур (менотропин) /FerrihgGmbh, Германия/.3. Перед началом стимуляции роста фолликулов результаты подавленияподтверждали базовыми исследованиями (УЗИ малого таза, анализ уровнярепродуктивных гормонов). УЗ-исследование производилось на 2,4-6, 8-11дни цикла, а также непосредственно перед пункцией фолликулов и передпереносом эмбрионов.4.
Для обеспечения достаточной толщины эндометрия к стимуляциидобавлялись препараты эстрогенов. Применяли таблетированный препаратПрогинова (эстрадиола валериат) /Shering, Франция/, в дозировке 2 мг/сут с5 по 21 дни менструального цикла.795. Овуляция индуцировалась подкожным или внутримышечным введениемхорионическогогонадотропиначеловека–Прегнил/Organon,Нидерланды/, Овитрель /Serono EuropеLtd., Великобритания/ - в дозе 500010000 ЕД при наличии как минимум одного доминантного фолликула ≥ 18мм в диаметре и 2-х фолликулов не менее 15 мм в диаметре. Введениепрепаратов ХГ осуществлялось за 36 часов до предполагаемой пункции.6.
Забор ооцитов проводился под внутривенной анестезией через 34-36 часовпосле инъекции ХГЧ путем вакуумной аспирации фолликулов подконтролем трансвагинального ультразвукового мониторинга отдельно изправого и левого яичника. Аспират помещали в подогретые пробиркиФалькона.7. Фолликулярный аспират немедленно исследовался врачом-эмбриологомна нагретом столике микроскопа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
