Диссертация (1140465), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Лабораторным путем было установлено, что препарат обладаетмультицентрическим эффектом, обладая антиоксидатной активность, высту39пая как донатор метильных групп, ингибитор ФНО-альфа и донатор глутатиона [188]. В клинических исследованиях установлено, что назначение 1200мг препарата приводит к повышению выживаемости пациентов, а такжеулучшением функции органа [189].Регенеративный потенциал печеночной ткани, в основе которого лежитмиграция стволовых клеток костного мозга и печеночных клетокпредшественников, является определяющим при обсуждении исходов у пациентов с фулминантным алкогольным гепатитом при АБП [190, 191]. К веществам, способным активировать данный процесс, относятся инсулин иглюкагон [192, 193], анаболические стероиды и оксандролон [194], пропилтиурацил [195, 196], однако в рамках проводимых исследований ни один изперечисленных фармакологических агентов не показал значимого терапевтического эффекта.В проведенных недавно исследования были получены обнадеживающие результаты использования колниестимулирующих факторов, таких какпрепаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и эритропоэтина.
Препараты оказывали выраженное гепатопротекторное действие, снижали частоту инфекционных осложнений и повышали выживаемость пациентов с АБП [197, 198].Таким образом, проблема фармакологической коррекции АБП далекаот своего разрешения, как остаются не изученными молекулярнобиологические процессы, лежащие в основе формирование патологическихпроцессов при алкоголь-ассоциированном поражении печени, что обусловливает актуальность выявления значимых морфофункциональных ассоциаций при разработке перспективных терапевтических стратегий при АБП.402.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯКонцепция представленной диссертационной работы построена на основе аргументированного предположения о способности органических, атакже магнийсодержащих, солей природных метаболитов – амино- и карбоновых кислот – предотвращать индуцированные этиловым алкоголем деструктивные процессы в ткани печени и ассоциированные с ними нарушенияфункциональной активности органа. При проведении теоретических построений, планировании исследования, проработке методологических и методических подходов к его выполнению основывались на таких принципах научного познания, как принципы адекватности, комплексности, целостности,внутреннего единства, необходимого и достаточного.2.1 Дизайн исследованияПоскольку настоящий диссертационный проект выполнен на стыкеморфологических и фармакологических наук, реализация принципа внутреннего единства требовала привлечения различных экспериментальных и лабораторных методов исследования.
В этой связи работа выполнялась в несколько этапов.Схематизированный дизайн исследования иллюстрирован рисунком 2.5.Первый этап работы был посвящен реферированию отечественных изарубежных литературных источников для выработки концепции исследования, отвечающей современным достижениям медицинской науки в областиэкспериментальной и клинической гепатологии, понимания ключевых механизмов повреждающего действия этилового спирта на печень млекопитающих и человека.
На данном этапе была проанализирована взаимосвязь междуактивацией или депрессией ключевых внутри- и межклеточных сигнальныхсистем и морфологическими изменениями печеночной паренхимы на различных уровнях организации материи – субклеточном, клеточном, тканевоми органном. Были также установлены и идентифицированы потенциальные41биомишени, воздействие на которые может эффективно предупреждать молекулярно-биологические изменения в печени, влекущие за собой нарушенияеѐ основных функций.Первый - аналитический - этапРеферирование литературных источникови выработка концепции исследованияРазработка протоколовэкспериментальных исследованийПланирование исследованияПроведение биоэтической экспертизыпротоколов исследованияВторой - подготовительный - этапВыбор оптимальных морфологических методов исследованияОпределение фармакологических методов выполнения работыПостановка эксперимента на крысахЗабор печени для морфологического, ИГХ исследования, ИФА и определенияактивности тканевого ПОЛ.
Забор крови для биохимических исследованийТретий экспериментальный этап (морфологический)Исследование роли экспрессии биологических маркеров регенерации (Ki-67, PCNA) иапоптоза (Bcl-2, каспаза-3) гепатоцитов методом ИГХ. Определение вовлеченностисигнальных систем ФНО-альфа, ИЛ-10 и ФРГ в развитие эффекта изучаемых веществИзучение макро- и микроструктуры печени крыс с острым алкогольным гепатитом нафоне профилактического действия исследуемых соединенийЧетвертый экспериментальный этапИзучение влияния соединений на активность процессов свободнорадикальнойлипопероксидации и антиоксилительный потенциал ткани печени в условиях острогоалкогольного пораженияИсследование влияния изучаемых соединений на активность цитолитического ихолестатического синдрома, а также некоторые функциональные показатели печениПятый этапПроведение статистического анализа полученных в работе экспериментальных данных, формулирование выводов, практическихрекомендацийРисунок 2.5 Дизайн исследования по изучению морфофункциональнойхарактеристики печени при остром алкогольном поражении на фонепрофилактического фармакологического воздействия42Также в рамках аналитического этапа настоящего исследования былпроработан его план, составлены подробные экспериментальные протоколыс учетом описаний применяемых лабораторно-экспериментальных методов итребований национальных регулирующих органов к выполнению работ с использованием животных и биологического материала.
На данном этапе осуществлена биоэтическая экспертиза протоколов диссертационного исследования и получено разрешение на его проведение.Основной задачей второго этапа диссертационного проекта было обоснование использования как морфологических, так и функциональных – фармакологических и биохимических методов исследования, которые бы позволили достичь поставленных в работе цели и задач.Кроме того, важнейшим вопросом, требовавшим разрешения на второмэтапе, был выбор оптимальной модели острого алкогольного поражения печени. Сложность выбора была продиктована сохраняющейся до настоящеговремени дискуссией в мировой и отечественной литературе по вопросу обадекватности моделирования острого алкогольного гепатита условиям реальной клинической практики.
В связи с этим за основу нами были взяты двафундаментальных источника – статью «Invivoandinvitromodelsofacutealcoholexposure» DolganiucandSzabo, увидевшуюсвет в 2009 [13] и «Методические рекомендации по изучению гепатопротективной активности лекарственных средств» А.И. Венгеровского и соавт. (2012) [14].Эксперимент включал моделирование алкогольного поражения печени,забор у экспериментальных животных, выведенных из опыта под наркозом,печени для проведения морфологического, ИГХ исследования и ИФА, определения активности тканевого ПОЛ, а также крови для биохимических исследований.На третьем этапе исследования проведено комплексное морфологическое исследование печени животных с острым алкогольным поражением органа.
Оценена макроструктура, измерена и рассчитана абсолютная и относительная масса печени животных опытных и контрольных групп. Проведена43сравнительная оценка микроструктурных изменений ткани печени в зависимости от вида профилактического фармакологического воздействия. На данном этапе работы было чрезвычайно важно установить молекулярноклеточные механизмы, вовлеченные как в патологический процесс, так и вмеханизм гепатозащитного действия фармакологических агентов, в связи счем были использованы иммуногистохимические методы исследования ключевых биологических маркеров программируемой гибели клеток и их пролиферации, а также методы иммуноферментного анализа для оценки вовлеченности сигнальных путей с участием ФНО-альфа, ИЛ-10 и ФРГ в патологический процесс.На четвертом этапе диссертационного исследования были изученыбиохимические маркеры алкогольного поражения печени наряду с некоторыми показателями, определяющими функциональную активность органа.Также в рамках этапа был изучен один из важнейших механизмов, участвующих в реализации алкогольного повреждения печени – свободнорадикальная липопероксидация и антиокислительный потенциал ткани методамиопределения ТБК-зависимых продуктов ПОЛ, активности антиоксидантныхферментов в плазме и ткани, а также методом индуцированной хемилюминисценции в модельной системе.На пятом – завершающем – этапе работы была проведена математикостатистическая обработка полученных экспериментально-лабораторных данных, с использованием функциональных возможностей методов логистической регрессии и отношения шансов были проанализированы взаимосвязиполученных морфологических и функциональных изменений, а также вкладотдельных факторов в реализацию гепатопротекторной активности исследуемых веществ при остром алкогольном поражении печени.2.2 Следование биоэтическим процедурам и нормативным актамНа заседании Локального этического комитета при федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования44«Национальный исследовательский Мордовский государственный университет им.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
