Диссертация (1140465), страница 17
Текст из файла (страница 17)
5.19).Фармацевтическая композиция ЛХТ-8-16, состоящая из деанолаацеглумата и альфа-липоевой кислоты, при курсовом 7-суточном внутриежелудочном введении в дозе 120 мг/кг/сут также оказывала влияние на тканевые уровни исследуемых цитокинов (рис. 5.19): так, под действием композиции происходило снижение концентрации ФНО-альфа при сравнении с контрольными значениями, однако депрессия показателя не достигала уровня102интактных животных. До интактных значений происходило восстановленияконцентрации в ткани печени ИЛ-10, тогда как содержание фактора роста гепатоцитов оставалось в рамках естественных компенсаторных реакций.Магнийсодержащий дериват 2-аминоэтансульфоновой кислоты ЛБК527 в дозе 100 мг/кг/сут также оказывал заметное влияние на тканевые концентрации цитокинов в печени животных с формирующимся острым алкогольным гепатитом (рис.
5.19): тканевая концентрация провоспалительногоцитокина ФНО-альфа восстанавливалась до нормальной концентрации,наблюдаемой в печени интактных животных, на 50% выше, чем в интактнойгруппе определялся уровень ИЛ-10. Что касается стимуляции клеточной гипертрофии и функции паренхимных клеток, то по этому показателю ЛБК-527воспроизводил эффект препарата сравнения известного гепатопротектора Sаденозил-L-метионина.5.2 Изучение уровня экспрессии маркеров апоптоза и пролиферации впечени крыс при остром алкогольном повреждении на фоне протекторного воздействия ЛБК-527 и ЛХТ-8-16В качестве антиапоптотического маркера использовали регуляторныйбелок Bcl-2, который вовлечен в регуляцию апоптоза широкого спектра клеток человека и животных, и действует как ингибитор программируемой клеточной гибели [216].
Реализация биологической роли протеина осуществляется посредством формирования гетеродимеров между Bcl-2 и стимуляторами апоптоза – белками семейства Вах [217]. Экспрессия Bcl-2 на мембранеклеток свидетельствует, кроме того, об их сенсибилизации к апоптотическимстимулам, таким как дефицит фактора роста нервов, радиоактивное излучение, некоторые химиотерапевтические лекарственные средства.На рис. 5.20 представлены микропрепараты печени крыс, обработанныеполиклональными кроличьими антителами анти-Bcl-2, группы интактныхживотных, на фоне формирования острого алкогольного повреждения, а также животных, наряду с воздействием токсических доз алкоголя получавших103абвгдРисунок 5.20 Bcl-2в клетках печени (ув.
400): а) печень интактной крысы; б) печень крысы с ОАП (контроль); печень крысы с алкогольнымпроцессом на фоне: в) АМ в дозе 60 мг/кг/сут; г) ЛХТ-8-16 в дозе 120мг/кг/сут; д) ЛБК-527 в дозе 100 мг/кг/сут; иммунопероксидазная реакция104гепатопротекторные лекарственные средства – препарат сравнения Sаденозил-L-метионин, вещества ЛБК-527 и ЛХТ-8-16 в дозах 60, 120 и 100мг/кг/сут.У интактных животных наблюдалась низкая экспрессия факторарегулятора апоптоза, о чем судили по слабой интенсивности коричневогоокрашивания гепатоцитов (рис.
5.20 а). Подобная иммуногистохимическаяхарактеристика имело место как в центральной части, так и на перифериидольки. На фоне формирования острого алкогольного гепатита в микропрепаратах печени животных происходило усиление экспрессии Bcl-2 (рис.5.20б), что может свидетельствовать о компенсаторной активации защитныхмеханизмов ткани на фоне формирующихся некрозов и воспалительной реакции: регистрировали умеренную иммуногистохимическую экспрессиюмаркера преимущественно в гепатоцитах центральных отделов дольки.КурсовоевнутрижелудочноевведениепрепаратасравненияS-аденозил-L-метионина в дозе 60 мг/кг сопровождалось гиперэкспрессиейBcl2в цитоплазме гепатоцитов, при этом подавление апоптотического процессараспространялось равномерно и на гепатоциты центра, так и периферии печеночной дольки (рис.
5.20 в). Фармацевтическая композиция деанолаацеглумата и липоевой кислоты ЛХТ-8-16 в дозе 120 мг/кг при 7-суточномвнутрижелудочном введении способствовала повышению экспрессии Bcl-2преимущественно в клетках центрального отдела дольки печени (рис. 5.20г).Антиапоптотический эффект ЛБК-527 в дозе 100 мг/кг/сут был наибольшими проявлялся окрашиванием наибольшей интенсивности мембран и цитоплазмы гепатоцитов преимущественно в центральном отделе дольки печени(рис. 5.20д). Одним из наиболее чувствительных биологических маркеровапоптоза печеночных клеток является каспаза-3 [222].
Активация этого цитоплазматического фермента происходит в результате запуска сигнальноговнутриклеточного пути регуляции апоптоза под действием митохондриальных мессендежеров. Активированный регуляторной каспазой-9 фермент является ключевым фактором фрагментации ДНК, и, наряду с каспазами-6 и 7,105участвующими в демонтаже цитоскелета и сморщивании клетки, представляет собой ключевой производительный механизм апоптотического процесса.абвгдРисунок 5.21 – Каспаза-3 в клетках печени (ув. 400): а) печень интактной крысы; б) печень крысы с ОАГ (контроль); печень крысы с алкогольным процессом на фоне: в) АМ в дозе 60 мг/кг/сут; г) ЛХТ-8-16 в дозе 120 мг/кг/сут; д) ЛБК-527 в дозе 100 мг/кг/сут; иммунопероксидазнаяреакция106На рис. 5.21 и 5.22 представлены результаты исследования экспрессиикаспазы 3 в цитоплазме гепатоцитов на фоне острого алкогольного поражения крыс и воздействия исследуемых соединений.В печени крыс интактной группы не наблюдали положительного окрашивания цитоплазмы при их инкубировании с антителами к каспазе-3.
Вконтрольной группе доля положительно окрашенныхгепатоцитов в среднемсоставляла 17,3% (рис. 5.21 б, рис. 5.22). Исследуемые нами вещества привведении в высших терапевтических дозах, обладали антиапоптотическимэффектом, о чем говорило снижение доли позитивно-окрашенных клеток впрепаратах печени животных на фоне курсового введения соединения ЛБК527 в дозе 100 мг/кг/сут в среднем до 0,3%, а фармацевтической композицииЛХТ-8-16 – в среднем до 4,5%.2017,31816% позитивно окрашенных клеток141210,4 *10864,5 *420,2 *0Интактные животныеКонтроль ОАПАМ, 60 мг/кг/сутЛХТ-8-16 120 мг/кг/сутЛБК-527 100 мг/кг/сутПримечание: * - различия достоверны при сравнении с контрольной группойпри р<0,05 (критерий Даннета)Рисунок 5.22 Доля позитивно окрашенных клетокна каспазу-3 в препаратах печени крыс исследуемых групп107Ki-67 представляет собой высокочувствительный маркер клеточнойпролиферации [219]. В исследованиях, проведенных коллективом авторовпод руководством Gerder, было показано, что экспрессия маркера наблюдается во всех фазах клеточного цикла, за исключением G0; в покоящихся клекахKi-67 полностью перестает экспрессироваться при переходе клетки в фазуG1[222].На рис.
5.23 показаны окрашенные гематоксилином Мейера микропрепараты печени, инкубированные с моноклональными мышиными антителамик Ki-67.Паренхима печени интактных крыс представлена находящимися в состоянии покоя непролиферирующими гепатоцитами (рис. 5.23 а). На фонеострого алкогольного повреждения также не наблюдали экспрессию Ki-67 нив центролобулярных, ни в периферических отделах дольки печени (рис. 5.23б). Фармакологическое воздействие в виде курсового внутрижелудочноговведения препарата сравнения, а также исследуемых веществ в высших терапевтических дозах сопровождалось повышением экспрессии маркера пролиферации, причем на фоне S-аденозил-L-метионина в дозе 60 мг/кг наблюдалипозитивное окрашивание ядер эндотелия синусоид, тогда как при использовании магнийсодержащего соединения 2-аминоэтансульфоновой кислотыЛБК-527 в дозе 100 мг/кг/сут положительная реакция наблюдалась преимущественно в ядрах гепатоцитов (рис.
5.23 в, г). Фармацевтическая композиция ЛХТ-8-16 не обладала способностью активировать пролиферацию гепатоцитов (рис. 5.23 д, рис. 5.24).Также оценили уровень экспрессии такого специфического биологического маркера, как ядерный активатор клеточной пролиферации (PCNA)[222]. Мы установили, что на 8 сутки после курсового введения этиловогоалкоголя крысам экспрессии PCNAне происходит, что свидетельствует оботсутствии активно пролиферирующих клеток печени в этот момент. Подобная же картина наблюдается и в препаратах интактных животных – позитивно окрашенные ядра не определяются (рис.
5.25 а). Полученные результатыполностью корреспондируют с таковыми для маркера Ki-67.108абвгдРисунок 5.23 Ki-67 в ядрах гепатоцитов крыс (показано стрелкой, ув.400): а) печень интактной крысы; б) печень крысы с ОАП (контроль);печень крысы с алкогольным процессом на фоне: в) АМ в дозе 60мг/кг/сут; г) ЛХТ-8-16 в дозе 120 мг/кг/сут; д) ЛБК-527 в дозе 100мг/кг/сут; иммунопероксидазная реакция1093,532,521,510,50Медиана индекса пролиферации %Интактные животныеКонтроль ОАПЛХТ-8-16 120 мг/кг/сутЛБК-527 100 мг/кг/сутАМ, 60 мг/кг/сутРисунок 5.24 – Значение индекса пролиферации (по уровню экспрессииKi-67) в печени крыс при ОАПНа фоне курсового введения препарата сравнения S-аденозил-Lметионина в дозе 60 мг/кг наблюдали незначительную активацию регенерации гепатоцитов, при этом количество регенерирующих клеток не превышало 2% от общего клеточного пула в полях зрения (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
