Диссертация (1140465), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В качестве маркеров апоптоза применяли Bcl-2и каспазу-3 [209], в качестве биомаркеровклеточной пролиферации и регенерации органа использовали Ki-67 и PCNA[221].Парафиновые срезы толщиной 3-4 мкм, расположенные на стеклах, покрытых полилизиновым слоем (Menzel-GlаserPolylisineSlides, Германия). Неокрашенные срезы от каждого случая обрабатывали с помощью стандартного58метода иммуногистохимии с термической демаскировкой антигенов.
Демаскировку проводили в водяной бане с микропроцессором BioOpticа (Милан,Италия): срезы были депарафинированы в ксилене, затем подвергались регидратации в серии спиртов различной концентрации и затем инкубированыв 3% перекиси водорода.Все дальнейшие этапы проведения иммуногистохимической реакциидля предотвращения высыхания срезов проводились во влажной камереSlideMaster (BioOptica, Милан, Италия).
Для блокировки эндогенной пероксидазы стекла инкубировали в течение 15 минут с 3% раствором Н2О2, послечего срезы ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0-7,6) и для блокирования неспецифических белковых взаимодействий инкубировали с Ultrа-VBlock (LаbVision, USА) в течение 30 минут.По окончании инкубации излишки реагента аккуратно стряхивали состекол и наносили первичные антитела.
В качестве первичных антител использовали кроличьи антитела к каспазе 3 (клон E87) (Genetex, разведение1:100) и Bcl-2 (клон С21) (SantaCruz, США), и мышиные антитела к Ki-67(клон ММ1) (NovoCastra, Великобритания) и PCNA (клон PC10) (Dako, разведение 1:100).Срезы инкубировали с первичными антителами в течение 30минут согласно предусмотренной фирмой производителем спецификации кантителу.После завершения инкубации срезы тщательно отмывали в фосфатномбуфере (рН 7,0-7,6) от первичных антител, не связавшихся с эпитопами. Длявыявления первичных антител, связавшихся с соответствующими антигенами, использовали универсальную полимерную систему Histofine® SimpleStain MAX PO (MULTI) (Nichirei, Япония), cодержащую декстрановый каркас с многократно присоединенными молекулами фермента пероксидазыхрена и вторичными антителами к антимышиным и антикроличьим иммуноглобулинам (Ig).
Время инкубации срезов с полимерной системой детекции во влажной камере составляло 30 минут.59По окончании инкубации срезы ополаскивали в фосфатном буфере (рН7,0-7,6). Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовали реакцию окисления субстрата 3,3-диаминобензидина (ДАБ) пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода с образованием нерастворимогов органических растворителях конечного продукта реакции, который был виден в виде коричневого окрашивания специфических структур клеток (NHistofine® DAB-2V, Nichirei, Япония).В зависимости от необходимой (желаемой) интенсивности окрашивания срезы инкубировали с ДАБ в течение 5-10 минут. Далее стекла ополаскивали в дистиллированной воде и подкрашивали ядра гематоксилином в течение 2-3 минут.
После этого стекла дегидратировали в ряде, состоящем издистиллированной воды, спиртах восходящей концентрации (70%, 80%, 95%,абсолютный спирт) и 3-х ксилолов. После чего срезы покрывали покровнымистеклами с использованием синтетической среды BioMount.При постановке иммуногистохимических реакций в обязательном порядке ставили положительные и отрицательные контроли. В качестве отрицательных контролей брали образцы исследуемых срезов, которые подвергались стандартной процедуре ИГХ исследования, но без добавления первичных антител.
Положительные контроли для каждого антитела выбирали в соответствии со спецификациями от фирмы производителя.Анализ иммуногистохимической реакции производили в 6 полях зрения (по 3 поля из центролобулярных и по 3 – из периферических отделов печеночной дольки) при увеличении х400. Для расчета доли каспаза-3позитивных и Bcl-2-позитивных клеток подсчитывали количество гепатоцитов с окрашенной цитоплазмой к общему числу клеток в исследуемых поляхзрения и полученное отношение выражали в процентах.Для оценки ИГХ реакции на Ki-67, PCNA определяли индекс пролиферации, для чего подсчитывали количество позитивно окрашенных ядер гепатоцитов и клеток синусоид в полях зрения, определяли их отношение к об-60щему числу ядер в исследуемых областях, и полученное отношение выражали в процентах.2.5.2 Биохимические методы исследованияВ рамках исследования активности цитолитического и холестатического синдромов, белоксинтетической функции, а также состояния пигментногообмена на 8-е сутки эксперимента в плазме крови животных первой подгруппы всех контрольных и опытных групп изучали концентрацию АСТ, АЛТ,ГГТП, ЩФ, общего белка, общего билирубина сухим способом на автоматическом ветеринарном биохимическом экспресс-анализаторе FUJI-DRI-CHEM4000ieпроизводства компании FUJI-FILM(Япония) производительностью 77тестов в час с использованиемдиагностических слайд-систем «FUJIDRICHEM» (Япония) (таблица 2.1).Приготовление образцов сыворотки крови.
3,5-4,0 л крови, взятой изполости левого желудочка крыс, помещали в пластиковые гепаринизированные пробирки и после многократного перемешивания и выдерживания в холодильнике при 40С в течение 1 часа центрифугировали при 1000 g в течение15 мин. Надосадочную жидкость сливали и с помощью микропипетки заливали 0,1 мл в специальный одноразовый пластиковый контейнер от биохимического анализатора.Диагностические тест-системы разработаны на основе следующих биохимических методов определения исследуемых веществ:1) Метод определения активности АЛТ в сыворотке крови унифицированным методом Reitman-Frankel [210].
Сущность метода заключается в образовании L-глутаминовой кислоты и пирувата в результате реакции трансаминирования, протекающей между альфа-кетоглутаровой кислотой и Lаланином при участии АЛТ. Добавление 2,4-динитрофенилгидразина в реакционную среду приводит к образованию дающих окрашивание в щелочнойсреде гидразонов пирувата. Интенсивность цветового окрашивания прямо61пропорциональна уровню ферментативной активности АЛТ, выраженной вU/л, где 1 U/л соответствует 16,67 нмоль/(с х л).2) Метод определения активности АСТ в сыворотке крови унифицированным методом Reitman-Frankel [210]. Сущность метода заключается в образовании L-глутаминовой кислоты и оксалоуксусной кислоты в результатереакции трансаминирования, протекающей между альфа-кетоглутаровойкислотой и L-аспарагиновой кислотой при участии АСТ.
Добавление 2,4динитрофенилгидразина в реакционную среду приводит к образованию дающих окрашивание в щелочной среде гидразонов пирувата и оксалоуксуснойкислоты. Интенсивность цветового окрашивания прямо пропорциональнауровню ферментативной активности АСТ, выраженной в U/л, где 1 U/л соответствует 16,67 нмоль/(с х л).3) Унифицированный колориметрический метод определения активностигамма-глутамилтранспептидазы(ГГТП)[211].Сущностьметодаосновананавсывороткеопределениикровиколичества4-нитроанилида, образующегося в результате каталитического – с помощьюГГТП – переноса с L-гамма-глутамилнитроанилида L-гамма-глутамиловогоостатка на глицилглицин.
Интенсивность цветового окрашивания прямо пропорциональна уровню ферментативной активности ГГТП, выраженной в U/л,где 1 U/л соответствует 16,67 нмоль/(с х л).4) Унифицированный метод Bessey, LowryandBrock [212] для определения активности ЩФ в сыворотке крови. Результатом ферментативной деградации пара-нитрофенилфосфата является получение пара-нитрофенола,дающего желтое окрашивание в щелочной среде.
Интенсивность цветовогоокрашивания прямо пропорциональна уровню ферментативной активностиГГТП, выраженной в U/л, где 1 U/л соответствует 16,67 нмоль/(с х л).5) Метод Ендрассика-Грофа [211] для определения сывороточной концентрации общего билирубина. Сущность метода состоит в реакции общегобилирубина, образованного при его диссоциации с участием кофеинового реагента, с сульфаниловой диазотированной кислотой.626) Метод [211] количественного определения общего белка в сыворотке крови.Сущность метода заключается в фотоколориметрическом измеренииинтенсивности окрашивания продукта реакции связывания с белком оранжевого красителя G250 Кумассипри трансформации его в синий.
Диапазон поглащения колеблется при этом от 465 до 595 нм. Показатель выражается в гобщего белка на 1 л сыворотки крови.2.5.3 Иммуноферментный метод исследования концентрацииФНО-альфа, ИЛ-10 и ФРГДля определения роли активации или подавления ключевых сигнальныхсистем в патологический процесс алкогольного поражения печени нафоне профилактического введения магния бис-ацетаминоэтансульфоноата(ЛБК-527) и фармацевтической комбинации деанола ацеглумата и альфалипоевой кислоты (ЛХТ-8-16) изучили тканевые концентрации ведущегопускового фактора печеночного воспаления – фактора некроза опухолейальфа (ФНО-альфа), цитокина с противовоспалительной активностью – ИЛ10, а также фактора роста гепатоцитов (ФРГ), ответственного за активациюрегенераторных процессов и клеточной дифференцировки, с помощью метода иммуноферментного анализа.ПРИНЦИП МЕТОДА.
В основу теста положен количественный твердофазный иммуноферментный анализа типа «сэндвич». Микропланшет на 96измерений, входящий в составе набора, покрыт специфическими моноклональными антителами к ФНО-α, ИЛ-10 или ФРГ крысы. В ходе реакции в отдельные лунки микропланшета вносили стандарты и образцы. ФНО-α, ИЛ-10или ФРГ, присутствующие в пробах стандартов и образцов, связываются симмобилизованными антителами. После промывки несвязавшиеся компоненты удаляли, и в каждую лунку микропланшета вносили конъюгат поликлональных антител к ФНО-α, ИЛ-10 или ФРГ с биотином.
После промывки вкаждую лунку вносили комплекс авидин – пероксидаза хрена (HPR). Послепромывки и удаления несвязанного авидин-ферментного комплекса, в лунки63вносили хромогенный субстрат. Интенсивность окраски была прямо пропорциональна количеству ФНО-α образца, ИЛ-10 или ФРГ.
Цветную реакциюостанавливали и измеряли интенсивность окраски.ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ. Приготовление тканевого гомогената.100 мг тканипечени крысы промывалиоднократно буфером PBS, гомогенизировали в 1 мл 1х PBS и хранили в течение ночи при -20°C в морозильнойкамере «SANYO» (Корея). После двух циклов размораживания и повторногозамораживания и размораживания происходило разрушение клеточных мембран, и гомогенаты центрифугировали в течение 5 минут при 5000 g и температуре 2-8 °С. Супернатант отделяли немедленно и исследовали. Аликвотыхранили при температуре -80°C в морозильной камере того же производителя.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
