Диссертация (1140465), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Они представляли собойбелый мелкокристаллический порошок без запаха (или, в случае с ЛБК-527, слегким запахом сероводорода), хорошо растворимые в воде. Поскольку во50всех экспериментальных группах использовался внутрижелудочный путьвведения, необходимое количество вещества смешивали с 2% крахмальнымклейстером extempore.Поскольку использование в качестве объекта исследования фармакологически активных веществ с ранее неустановленной активностью на исследуемой модели требует сравнения с эталоном, на всех этапах настоящего диссертационного проекта использовали препараты сравнения.Разделы работы по изучению морфофункциональных изменений печени крыс выполнены с использованием в качестве препарата сравнения гепатопротектора S-аденозил-L-метионина 1,4-бутандисульфонат, выпускающееся зарубежной фармацевтической промышленностью под коммерческимназванием «Гептрал»®, проявляющее гепатопротекторное действие при лекарственном, токсическом и алкогольном гепатите [200-203].
В работе использовали официнальную лекарственную формупрепарата во флаконах, содержащих 760 мг лиофилизата действующего вещества, и ампулы по 5 мл срастворителем для внутривенного и внутримышечного введения, производства компании «Фамар Л’Эйль», Франция, номер серии 79134ТВ22 со срокомгодности до 09.2018.Исследуемые соединение, фармацевтическую композицию и препаратысравнения животные получали внутрижелудочно ежедневно за 1 час до введения этанола в эквитоксических дозах, составляющих 5 и 2,5% от показателя ЛД50, определенного для данного вида животных при указанном пути введения. Дозы составили: 100 и 50 мг/кг для ЛБК-527, 120 и 60 мг/кг для ЛХТ8-16, и 60 и 30 мг/кг для препарата сравнения S-аденозил-метионина в течение недели.
Как уже упоминалось ранее все лекарственные формы вводилисьчерез специальный зонд в 2% крахмальном геле в общем объеме 0,8-1,0 мл,допустимом для внутрижелудочного введения данному виду животных [204,205]. Для воспроизведения острого алкогольного гепатита использовалиспирт этиловый ректификованный 96% и дважды дистиллированную воду,приготовляемую с использованием дистиллятора "Liston-1210".51Таблица 2.1Характеристика диагностических систем и наборов антител, использующихся при проведении морфологическихи биохимических исследований№ п/п1Название диагностической системыСтранапроизводитель2Объем /Каталожный номер3Количествоопределений45ВеликобританияАСК02100 мклСШАsc-78350 мклГерманияMS-1123-R11 млДанияMS-1123-R11 млИммуногистохимическое исследование1.2.Mouse Monoclonal Anti-Ki-67 (Clone MM1)(K-2), IgG1, Novo CastraRabbit Polyclonal IgG Bcl-2 Antibody (C21)Santa CruzRabbit PolyclonalAnti-Caspase 3 (dilution3.1:100) clone ES87GenetexMouse Monoclonal Proliferating Cells Nu-4.clear Antigen (PCNA)клонPC100Dako52Таблица 2.1 (продолжение)12345СШАJ2915348796СШАN0615348396СШАL0615348696Япония12020820Япония40741220Иммуноферментный анализ5.6.RatTNF-aELISAKIT, CUSABIOBIOTECHCo., LTDRat Interleukin 10 (IL10) ELISA KIT,CUSABIOBIOTECHCo., LTDБиохимические исследования7.8.9.Rat Hepatocyte Growth Factor (HGF) ELISAKIT, CUSABIOBIOTECHCo., LTDЩелочная фосфатаза – ALP-PIII, FUJIGRICHEMОбщий билирубин – TBIL-PIII, FUJIGRICHEM10.ГГТП – GGT-PIII, FUJI GRI-CHEMЯпония1336112011.АСТ – GOT/AST-PIII, FUJI GRI-CHEMЯпония4501112012.АЛТ – GPT/ALT-PIII, FUJI GRI-CHEMЯпония4650112013.Общий белок – ALB-P, FUJIGRI-CHEMЯпония1139132053При изучении концентрации ферментов цитолиза – аланиновой и аспарагиновой трансаминаз, гамма-глутамилтранспептидазы, щелочной фосфатазы, общего белка, общего билирубина в сыворотке крови лабораторных животных использовали диагностические наборы «FUJI-FILM» (Япония), краткая характеристика которых представлена в таблице 2.1.Иммуногистохимическое исследование проводили с использованиеммоноклональных антител мыши производства «NovoCastra» (Великобритания)и поликлональных кроличьих антител производства компании «SantaCruz» (США), в качестве первичных антител использовали кроличьи антитела к каспазе 3 и мышиные антитела к PCNA (Dako, Дания).
Для определения концентрации цитокинов – интерлейкина-10, фактора некроза опухолейальфа и фактора роста гепатоцитов использовали наборы диагностикумов,разработанныхдляисследовательскихцелейCUSABIOBIOTECHCo.,LTD(США).2.4 Модель острого алкогольного поражения печениДля воспроизведения острого алкогольного повреждения печени использовали метод, описанный DolganiucandSzabo (2009) и А.И.
Венгеровскими соавт. (2012).ПРОТОКОЛ ЭКСПЕРИМЕНТА. Половозрелую особь белой нелинейной крысы самца или самки исходным весом 180-220 г маркировали с помощью специального маркера. С помощью зонда G24, введенного на глубину3,5-4,0 см через ротовую полость внутрижелудочно вводили 40% водныйраствор спирта этилового ректификованного, приготовленный extempore иохлажденный до комнатной температуры, в дозе 8 мл 96% спирта на 1 кг весатела. Общий объем вводимого раствора доводили дважды дистиллированнойводой до 3 мл.
Процедуру повторяли в течение 7 суток в одно и то же время(между 11 и 12 часами утра). Животные разного пола содержались изолированно. Крыс не ограничивали в доступе к корму и воде в течение всегонаблюдения. Животным интактного контроля в указанное время вводили54внутрижелудочно 3 мл 0,9% изотонического раствора хлорида натрия. Исследуемые вещество ЛБК-527, фармацевтическую композициюЛХТ-8-16 илиреферентное лекарственное средство вводили внутрижелудочно через зонд за1 час до введения раствора этилового алкоголя в общем объеме, не превышающем 1,5 мл, на протяжении всего эксперимента. На восьмые сутки алкоголь и лекарственное вещество не вводили; животное после взвешивания наэлектронных весах «ACCULAB» (США) иммобилизовывали на подогреваемой площадкеот аппарата неинвазивной регистрации АД «CODA», под легким эфирным наркозом проводили интубацию трахеи, переводили на искусственную вентиляцию.
Под галотановым наркозом вскрывали грудную клетку и забирали 3,5-4 мл артериальной крови из полости левого желудочка дляпроведения иммуноферментного и биохимического раздела работы. Послечего животное выводили из эксперимента, печень извлекали, взвешивали,фотографировали и осуществляли подготовку для гистологического исследования (см. параграф 2.6).2.5 Методы исследования2.5.1 Морфологические методы исследованияВ рамках настоящего исследования проводили анализ макроскопических и микроскопических изменений печени животных. Материалом дляморфологического исследования служила печень крыс исследуемых групп иразделенных на две подгруппы случайным образом, взятая на 8 сутки послевыведения животных из эксперимента. Из печени каждого животного первойподгруппы получали по одному блоку для микроморфологического и иммуногистохимического исследования, у каждого животного второй подгруппыполучали образцы свежей печени для гистохимического исследовани.
Примакроморфологическом исследовании осуществляли взвешивание органа,расчет его относительной массы, описывали визуальную картину, включающую форму, размер, цвет, внешнее состояние печеночной капсулы и краев55органа, наличие видимых патологических изменений как на поверхности, таки на срезе.2.5.1.1 Гистологическое исследование печениФрагменты из центральных участков печени животных размером до 1см3 забирали и фиксировали в нейтральном забуференном 10% раствореформалина на протяжении не менее, чем 24 и не более, чем 48 часов. Гистологическую проводку биологического материала осуществляли в автоматическом режиме с использованием автоматической станциимарки «STP-120»(типа «Карусель», производства Германии), последующую парафинизациюблоков также проводили автоматически, применяли систему«EC350» (производства Германии).
Для приготовления микропрепаратовиспользовали ротационныймикротоммарки«НМ340Е»производствакомпании«MicromLaborgerate GmbH» (Германия). Из каждого парафинового бока изготавливали по 6-10 срезов толщиной 4-5 мкм, проводили наклеивание изна предметные стекла влажным способом и высушивание при температуре 37 0С не менее 48 часов в термостате. Для последующего гистологического окрашивания гематоксилином и эозиномосуществляли депарафинирование и регидратацию препаратов в колонке реагентов в следующей последовательности:Ксилол – 2 смены по 7 минутАбсолютный этиловый спирт – 5 минЭтиловый спирт 96% – 5 минВода дистиллированная – от 5 до 10 минОкрашивание гематоксилином и эозином.
Проводили окрашивание поХеллендахелю, для чегодепарафинированные предметные стекла с препаратами печени крыс помещали в емкость, содержащую квасцовый гематоксилин Караци (время экспозиции 1,5-2,0 мин) с последующей промывкой впроточной водопроводной воде. После проведения окрашивания эозином(время экспозиции – 0,5 мин) препараты промывали дважды дистиллированной водой, обезвоживали с использованием 96% этилового спирта (экспози56ция 1 мин) и просветляли (использовали ксилол в течение 0,5 мин).
Послепроведения описанных манипуляций препарата накрывали покровным стеклом с канадским бальзамом.Окрашивание суданом-III. Проводили окрашивание по методу О.В.Волковой и Ю.К. Елецкому (1982). Замороженные срезы свежей нефиксированной печени крыс помещали в 50% этанол на 5-6 мин, затем в течение 5минут выдерживали в щелочном растворе судана-III, ополаскивали в 50%растворе этилового спирта и промывали в дистиллированной воде. Послеэтого производили корашивание ядер гематоксилином Эрлиха и заключали вглицерин-желатин.2.5.1.2 Морфометрический анализВизуализацию изображений осуществляли с использованием световогомикроскопа марки «OLYMPUSBX51» (Япония).
Морфометрию срезов печени анализировали с помощью программы анализа изображений «ImageScopeColor» и «cellSensStandart» (Россия). С этой целью проводили микрофотосъемку случайных полей зрения гистологических препаратов цифровой камерой «OLYMPUSXCOLYMPUSXC-30»(Япония) на базе микроскопа«OLYMPUSBX51» (Япония) при увеличении окуляра SWHx10 и объективовUPLanFL х200, х400 (не менее 10 полей зрения в каждом гистологическомсрезе). Определяли среднюю площадь гепатоцитов и их ядер в мкм2, а такжевычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО).
Осуществлялиподсчет двухъядерных гепатоцитов.Применяли две полуколичественные системыанализа тяжести острогоалкогольного поражения печени.Для оценки распространенности воспалительно-дистрофических реакций в паренхиме органа использовали следующую оценочную шкалу[208]:0 – отсутствуют признаки воспалительной реакции и дистрофическихявлений гепатоцитов;57+ – воспалительный процесс и дистрофия охватывают не более 33%паренхимы печени;++ – воспалительный процесс и дистрофические явления в гепатоцитахраспротсраняются на площадь, равную 33-66% паренхимы органа;+++ – более 66% площади паренхимы печени вовлечены в воспалительно-дистрофический процесс.Для характеристики активности воспалительной реакции, вызваннойвоздействием токсических доз этилового алкоголя, пользовались шкалойКноделя, согласно которой суммарный индекс формируется сложением баллов, получаемых по следующим категориям: 1) периопртальный или мостовидный некроз (0 – 10 баллов); 2) некроз долей печени (0 – 4 балла); 3) портальное воспаление (0 – 4 балла); 3) фиброз (0 – 4 балла).
Интерпретациясуммарного индекса осуществлялась следующим образом:0 – отсутствие воспаления;1 – 4 – воспаление минимально;5 – 8 – небольшое воспаление;9 – 12 – умеренное воспаление;13 – 18 – значительное воспаление.2.5.1.3 Иммуногистохимический метод исследованияОсновной задачей использования иммуногистохимического исследования в настоящей работе было определение экспрессии биологических маркеров программируемой гибели печеночных паренхиматозных клеток и активности пролиферативно-регенераторных процессов в органе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
