Автореферат (1140464), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Для выявления первичных антител, связавшихся с соответствующими антигенами, использовали универсальную полимерную систему Histofine® Simple Stain MAX PO (MULTI) (Nichirei, Япония).Анализ ИГХ реакции производили в 6 полях зрения (по 3 поля из центролобулярных и по 3 – изпериферических отделов печеночной дольки) при увеличении х400. Для расчета доли каспаза-3позитивных и Bcl-2-позитивных клеток подсчитывали количество гепатоцитов с окрашенной11цитоплазмой к общему числу клеток в исследуемых полях зрения и полученное отношение выражали в процентах. Для оценки ИГХ реакции на Ki-67, PCNA определяли индекс пролиферации, для чего подсчитывали количество позитивно окрашенных ядер гепатоцитов и клеток синусоид в полях зрения, определяли их отношение к общему числу ядер в исследуемых областях, и полученное отношение выражали в процентах.Биохимические методы исследования.
На 8-е сутки эксперимента в плазме крови животных, полученной из полости левого желудочка, всех контрольных и опытных групп изучаликонцентрацию АСТ, АЛТ, ГГТП, ЩФ, общего белка, общего билирубина сухим способом наавтоматическом ветеринарном биохимическом экспресс-анализаторе FUJI-DRI-CHEM 4000ieпроизводства компании FUJI-FILM (Япония).Количественный ИФА. Методом количественного ИФА изучили концентрации ФНОальфа, цитокина с противовоспалительной активностью – ИЛ-10, а также фактора роста гепатоцитов в гомогентах печени крыс с применением ридера StatFax 4200 (США).Исследование ПОЛ и антирадикальной активности в ткани печени проводили хемилюминесцентным методом на электрофотометре Emilit EL, а в плазме крови – путем определения активности каталазы и ТБК-зависимых продуктов ПОЛ.Статистическая обработка данных.
При сравнении количественных признаков проводили дисперсионный анализ для оценки нормальности распределения (ANOVA) с последующим использованием критериев оценки множественных сравнений Ньюмена-Кейлса или Даннета. Достоверность результатов сравнения качественных признаков оценивали с помощью непараметрического точного критерия Фишера. При изучении различий признаков до и послевоздействия применяли критерий Уилкоксона при 5% уровне значимости.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕЖивотные контрольной группы, получавшие токсические дозы алкоголя имели увеличенную, плотную, ярко-желтую как на поверхности, так и на разрезе, с красноватыми илиокрашенными желчью участками печень, края органы были закруглены.
При этом, как у самцов, так и у самок регистрировали рост веса печени, причем в группе самцов орган увеличивался в весе в среднем на 83%, а в группе самок – на 74% по сравнению с интактными животнымисоответствующего пола. Происходили и пропорциональные изменения показателя относительной массы органа (табл.1).Микроскопическая картина алкогольного повреждения печени соответствовала явлениям гибели паренхиматозных клеток с формирующейся умеренной активностью воспалительного процесса по шкале Кноделя (табл. 2): отмечали полнокровие ткани с расширением сосудов исинусоид, явлением агрегации, сладжа эритроцитов и частичным внутрисосудистым гемолизом12эритроцитов.
Дольчатое строение печеночной ткани размыто, печеночные балки дискомплексированы. Наблюдались центролобулярные некрозы гепатоцитов.Таблица 1Значения абсолютной и относительной масс печени крыс (MSD) с острым алкогольнымпоражением печени под действием исследуемых соединенийИсследуемая группаМасса животного, г,Абсолютная масса,Относительная масса,самец/самкапечени, г самец/самкапечени, самец/самкаИнтактные195,2±10,65,9±0,70,026±0,002животные245,0±13,28,3±0,20,030±0,001Контроль с ОАП282,3±10,2*10,8±0,3*0,039±0,001*312,9±11,214,8±0,6*0,047±0,001*АОАП, АМ в дозе 60260,3±12,67,8±0,50,031±0,002Амг/кг314,4±11,38,9±0,6А0,029±0,001ААОАП, АМ в дозе 30273,7±10,4*9,5±0,7*0,034±0,002*Амг/кг322,8±9,811,3±0,5А0,035±0,002ААОАП, ЛХТ-8-16 в дозе276,4±10,3*8,3±0,5*0,030±0,001А120 мг/кг337,2±11,1*10,7±0,5*А0,031±0,001ААОАП, ЛХТ-8-16 в дозе284,7±8,6*8,9±0,4*0,031±0,001А60 мг/кг315,4±10,511,3±0,3*А0,035±0,001*АОАП, ЛБК-527 в дозе267,4±10,27,4±0,3А0,028±0,001АА100 мг/кг302,6±10,48,8±0,40,027±0,002АОАП, ЛБК-527 в дозе278,2±11,6*8,1±0,4*А0,029±0,001АА50 мг/кг314,5±9,7*9,7±0,40,031±0,002АПримечание: АМ – S-аденозил-L-метионин; * - различия при сравнении с интактными крысамистатистически достоверны при р<0,05;А– различия при сравнении с группой контроля стати-стически достоверны при р<0,05 (ANOVA, критерий Даннета)Гепатоциты центра дольки с явлениями кариопикноза, кариолизиса, вакуолизации и лизиса цитоплазмы, свидетельствующие о формировании явлений дистрофии и цитолиза.
Припроведении гистохимического исследования у крыс контрольной группы регистрировали формирование смешанного (крупно- и мелкокапельного) стеатоза, преимущественно затрагивающие портальные тракты и перипортальные зоны (рис. 1).Магниевая соль 2-аминоэтансульфоновой кислоты в обеих изученных дозах сдерживалоувеличение массы органа, наблюдаемое в контроле (табл.
1). А также уменьшало развитие дистрофических и воспалительных явлений в органе (минимальное воспаление или отсутствие такового по Кноделю) (табл. 2).Гепатопротекторное действие соединения ЛБК-527 заметно снижало выраженность явлений жировой дистрофии, что проявлялось как в уменьшении доли подверженных патологическим изменениям гепатоцитов, так и площади цитоплазмы паренхиматозных клеток, занятыхкаплями жира (рис.
1). В совокупности с описываемыми феноменами статистически значимое13при сравнении с контролем увеличение доли двухъядерных гепатоцитов свидетельствовало обактивации регенераторных механизмов в ткани органа.Таблица 2Значение индекса гистологической активности гепатита по Кноделю в группах крыс сострым алкогольным поражением под действием исследуемых соединенийИсследуемаягруппаАктивность воспаленияМинимальнаяНебольшая(1-4)(5-8)232А611-Отсутствует0108А7А8А4*10А9АИнтактные животныеКонтроль с ОАПОАП, АМ, 60 мг/кгОАП, АМ, 30 мг/кгОАП, ЛХТ-8-16, 120 мг/кгОАП, ЛХТ-8-16, 60 мг/кгОАП, ЛБК-527, 100 мг/кгОАП, ЛБК-527, 50 мг/кгУмеренная(9-12)10*-Примечание: * - различия при сравнении с интактными крысами статистически достоверны при р<0,05;А– разли-чия при сравнении с группой контроля статистически достоверны при р<0,05 (точный критерий ФишераКонтроль с ОАГГептрал 60 мг/кг9080ЛБК-527 100 мг/кгЛХТ-8-16 120 мг/кгв%787056604950303834*4029*2827*20100Доля гепатоцитов с явлениями жировой дистрофииДоля цитоплазмы, занятая жировыми каплямиПримечание: * - различия при сравнении с контролем с ОАП статистически значимы при р<0,05 (критерий Даннета)Рисунок 1 – Морфометрическая характеристика явлений жировой дистрофии печеникрыс при остром алкогольном поражении и действии ЛБК-527 и ЛХТ-8-16Для наиболее объективного суждения об активности процессов программируемой гибели гепатоцитов и регенераторно-пролиферативного потенциала паренхимы печени с использованием иммуногистохимического метода изучили уровень экспрессии активатора апоптоза кас14пазы-3, антиапоптотического фактора Bcl-2, ядерных маркеров пролиферации Ki-67 и PCNA впрепаратах печени крыс.
На фоне формирования острого алкогольного повреждения происходило усиление экспрессии каспазы-3, свидетельствующее об активации апоптоза (рис. 2).абвгРисунок 2 – Каспаза-3 в клетках печени (ув. 400): а) печень крысы с ОАГ (контроль); печень крысы с алкогольным процессом на фоне: б) АМ в дозе 60 мг/кг/сут; в) ЛХТ-8-16 вдозе 120 мг/кг/сут; г) ЛБК-527 в дозе 100 мг/кг/сут; иммунопероксидазная реакцияЭффект ЛБК-527 проявлялся почти полным отсутствием окрашивания мембран и цитоплазмы гепатоцитов как в центральном отделе дольки печени, так и на периферии.
При курсовом внутрижелудочном введение ЛБК-527 наблюдалась гиперэкспрессией антиапоптотическогорегуляторного маркера Bcl-2 в цитоплазме гепатоцитов (рис.3).Алкогольная интоксикация приводила к умеренной экспрессия Ki-67, что может говорить о компенса -торной активации защитных механизмов ткани на фоне формирующихсянекрозов и воспалительной реакции (рис.4). Экспрессию PCNA ни в центролобулярных, ни впериферических отделах дольки печени мы не регистрировали.15абвгРисунок 3 – Bcl-2 в клетках печени (ув.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
