Автореферат (1140464), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Н.П. Огарѐва», протокол №7 от 03.09.2018 г. Результаты диссертации заслушивались на совместном заседании кафедр патологической анатомии им. академикаА.И. Струкова и оперативной хирургии и топографической анатомии ФГАОУ ВО ПервыйМГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет).Результаты исследований докладывались на XIII конгрессе международной ассоциацииморфологов (Тюмень, 2016), XXIII и XXV Российских национальных конгрессах «Человек илекарство» (Москва, 2016, 2018), XIX Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2016); V-VII Всероссийских студенческих научных форумах с участиеммолодых исследователей «Актуальные проблемы медицинских наук» (Саранск, 20162018);XVII Российском национальном конгрессе гастроэнтерологов (Санкт-Петербург, 2017).Личный вклад автораМ.С.
Хальзова сформулировала концепцию настоящего исследования, разработала дизайн и детальный план его проведения, лично осуществляла анализ отечественной и зарубежной научной периодики. Лично автором выполнены все эксперименты по воспроизведениюострого алкогольного повреждения печени, введению лекарственных веществ. Автор принимала непосредственное участие в приготовлении гистологических препаратов, их изучении, проведении морфометрического анализа.
Автор самостоятельно проводила биохимические исследования крови животных, а также иммуноферментный анализ гомогенатов печени. При деятельном участии автора проведено иммуногистохимическое исследования. Лично автором велись все записи исследования, сбор, группировка и статистическая сводка полученных результатов, и их математическая обработка. Автор принимала непосредственное участие в подготовке публикаций по теме диссертации.
Ею написаны рукописи диссертации и автореферата.Соответствие диссертации паспорту научной специальностиОсновные положения диссертационной работы соответствуют паспорту научной специальности 14.03.02 – Патологическая анатомия, области исследований «Исследование патогенетических механизмов развития заболеваний в целом и отдельных их проявлений (симптомы,синдромы), создание основ патогенетической терапии», а также паспорту научной специальности 14.03.06 – Фармакология, клиническая фармакология, области исследований «Поиск новыхбиологически активных фармакологических веществ среди природных и впервые синтезиро8ванных соединений, продуктов биотехнологии, генной инженерии и других современных технологий на экспериментальных моделях патологических состояний.Публикации по теме диссертационной работыПо теме диссертационного исследования опубликовано 8 научных работ, из них 5 оригинальных статей – в центральных рецензируемых изданиях и журналах, рекомендованныхВАК Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, из которых 2 статьив изданиях, индексируемых международной системой цитирования Scopus; а также 1 патент наизобретение Российской Федерации.Объѐм и структура работыДиссертация изложена в традиционном стиле, включает введение, главу с описанием материалов и методов исследования, трех глав с изложением полученных результатов, главы «Заключение», в которой подведены итоги выполнения работы, очерчены перспективы дальнейшей разработки темы исследования, даны практические рекомендации, а также выводов.Диссертация изложена на 149 страницах компьютерного текста, иллюстрирована двадцатью пятью рисунками и девятью таблицами.
Библиографический список содержит 222 работ, из которых 18 – отечественных и 204 – зарубежных авторов.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериал и методы исследованияЛабораторные животные и формирование экспериментальных групп. Исследованиевыполнено на 160 белых нелинейных крысах самцах (80 особей) и самках (80 особей) исходнымвесом 180-220 г, полученных в филиалах «Андреевка» и «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБАРоссии, в соответствии с требованиями приказа Минздрава России №199н от 01.04.2016 г.
«Обутверждении правил надлежащей лабораторной практики», основываясь на принципах гуманного обращения с подопытными животными. Протоколы лабораторных экспериментов прошлиэтическую экспертизу на заседании Локального этического комитета Медицинского институтаФГБОУ ВО «МГУ им. Н.П. Огарѐва» (13 ноября 2017 года, протокол №56). Каждая группавключала по 20 крыс: по 10 самцов и 10 самок.
Количество животных определяли в связи сбольшим объемом лабораторных и морфологических исследований и необходимостью получения достаточного количества биологического материала. При заборе материала в каждой экспериментальной группе животных случайным образом разделяли на две подгруппы по 10 особейв каждой (по 5 самцов и 5 самок). У крыс первой подгруппы забирали печень на приготовлениеблоков для микроскопического исследования и ИГХ, у крыс второй подгруппы извлеченнуюпечень использовали для окрашивания суданом-III и проведения ИФА, а также определения активности ПОЛ. Кровь у животных первой подгруппы использовалась для биохимического исследования, в второй – для изучения системного ПОЛ.9Метод моделирования острого алкогольного повреждения печени.
Для воспроизведения острого алкогольного повреждения печени использовали метод, описанный Dolganiuc andSzabo (2009) и А.И. Венгеровским и соавт. (2012). Половозрелой особи белой нелинейной крысы с помощью зонда G24, введенного на глубину 3,5-4,0 см через ротовую полость, внутрижелудочно вводили 40% водный раствор спирта этилового ректификованного, приготовленный extempore и охлажденный до комнатной температуры, в дозе 8 мл 96% спирта на 1 кг веса тела.Общий объем вводимого раствора доводили дважды дистиллированной водой до 3 мл.
Процедуру повторяли в течение 7 суток в одно и то же время (между 11 и 12 часами утра).Лекарственные вещества, диагностические системы, антитела. В работе изучилиморфофункциональные изменения печени под действием двух оригинальных лекарственныхвеществ в виде субстанций, наработанных в отделе химии и технологии синтетических лекарственных средств АО «ВНЦ БАВ» (Россия) и предоставленных нам для исследования. Первоевещество (лабораторный шифр – ЛБК-527) – магния бис-ацетаминоэтансульфоноат. Второе вещество является стабильной фармацевтической композицией деанола ацеглумата с альфалипоевой кислотой (лабораторный шифр разработчика ЛХТ-8-16), в 1 г которой содержится по250 мг каждого из действующих веществ.
Разделы работы по изучению морфофункциональныхизменений печени крыс выполнены с использованием в качестве препарата сравнения гепатопротектора S-аденозил-L-метионина 1,4-бутандисульфоната под коммерческим названием«Гептрал»® во флаконах, содержащих 760 мг лиофилизата действующего вещества, и ампулыпо 5 мл с растворителем для внутривенного и внутримышечного введения, производства компании «Фамар Л’Эйль» (Франция, номер серии 79134ТВ22 со сроком годности до 09.2018).
Исследуемые вещества животные получали внутрижелудочно ежедневно за 1 час до введения этанола в эквитоксических дозах, составляющих 5 и 2,5% от показателя ЛД 50, определенного дляданного вида животных при указанном пути введения. Дозы составили: 100 и 50 мг/кг для ЛБК527, 120 и 60 мг/кг для ЛХТ-8-16, и 60 и 30 мг/кг для препарата сравнения, в течение недели.При изучении концентрации АСТ, АЛТ, ГГТП, ЩФ, общего белка, общего билирубина всыворотке крови лабораторных животных использовали диагностические наборы «FUJI-FILM»(Япония). Для ИГХ исследования использовали кроличьи антитела к каспазе-3 (клон E87)(Genetex, разведение 1:100) и Bcl-2 (клон С21) (Santa Cruz, США), и мышиные антитела к Ki-67(клон ММ1) (Novo Castra, Великобритания) и PCNA (клон PC10) (Dako, разведение 1:100).
Дляопределения концентрации цитокинов – ИЛ-10, ФНО-альфа и ФРГ использовали тест-системы,разработанные для исследовательских целей CUSABIO BIOTECH Co., LTD (США).Методы исследованияПри макроскопическом исследовании осуществляли взвешивание органа, расчет егоотносительной массы, описывали визуальную картину, включающую форму, размер, цвет,10внешнее состояние печеночной капсулы и краев органа, наличие видимых патологических изменений как на поверхности, так и на срезе.Гистологические методы исследования. Гистологическую проводку биологическогоматериала осуществляли в автоматическом режиме с использованием автоматической станциимарки «STP-120» (типа «Карусель», производства Германии), последующую парафинизациюблоков также проводили автоматически, применяли систему «EC350» (производства Германии).
Для приготовления микропрепаратов использовали ротационный микротом марки«НМ340Е» производства компании «Microm Laborgerate GmbH» (Германия). Из каждого парафинового бока изготавливали по 6-10 срезов толщиной 4-5 мкм. Окрашивание гематоксилиноми эозином осуществляли по Хеллендахелю. Окрашивание суданом-III проводили по методуО.В. Волковой и Ю.К.
Елецкого (1982) с использованием замороженных срезов свежей нефиксированной печени крыс и щелочного раствора судана-III.Морфометрический анализ. Визуализацию изображений осуществляли с использованием светового микроскопа марки «OLYMPUS BX51» (Япония). Морфометрию срезов печенианализировали с помощью программы анализа изображений «Image Scope Color» и «cellSensStandart» (Россия). С этой целью проводили микрофотосъемку случайных полей зрения гистологических препаратов цифровой камерой «OLYMPUS XCOLYMPUS XC-30» (Япония) на баземикроскопа «OLYMPUS BX51» (Япония) при увеличении окуляра SWH x10 и объективов UPLanFL х200, х400 (не менее 10 полей зрения в каждом гистологическом срезе). Определялисреднююплощадьгепатоцитовиихядервмкм2,атакжевычислялиядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО).
Осуществляли подсчет двухъядерных гепатоцитов.Применяли две полуколичественные системы анализа тяжести острого алкогольного пораженияпечени. Для оценки распространенности воспалительно-дистрофических реакций в паренхимеоргана использовали оценочную шкалу Zhao et al. (2017). Для характеристики активности воспаления, вызванной воздействием токсических доз этилового алкоголя, пользовались гистологической шкалой Кноделя.Иммуногистохимический метод исследования. Использовали парафиновые срезытолщиной 3-4 мкм, расположенные на стеклах, покрытых полилизиновым слоем (Menzel-GlаserPolylisine Slides, Германия). Неокрашенные срезы от каждого случая обрабатывали с помощьюстандартного метода иммуногистохимии с термической демаскировкой антигенов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
