Диссертация (1140408), страница 7
Текст из файла (страница 7)
максимальной доступностью большого количества лабораторных животных;2. высокой скоростью регенерационных процессов;3. однородностью популяции, позволяющей уменьшить разброс статистическихданных.2.2 Материалы исследованияМатериалом для настоящегоисследования стали 2 экспериментальныхобразца эндопротезов с нанесением ионов серебра – Эсфил Ag и Унифлекс Ag.Для сравнения использовали эндопротез с антибактериальными свойствамиПлазмофильтр,выпускающийсяЗАО"Плазмофильтр"иразрешенный кприменению.
В качестве контрольных материалов были взяты стандартные35эндопротезы Эсфил и Унифлекс без нанесение ионов серебра. Сведения офизико-химических свойствах и способах изготовления 5 сравниваемых образцовпредставлены в таблице 2.Таблица 2 - Характеристика исследуемых образцовЭндопротезМатериалДиаметр нитиТолщинапротезаПоверхностная плотностьЭсфилУнифлексПлазмофильтрПППВДФлавсан0,12 мм0,12 мм0,10 мм0,50 мм0,48 мм0,35 мм75 г/м2160 г/м2105 г/м2Эсфил AgПП0,12 мм0,50 мм75 г/м2Унифлекс AgПВДФ0,12 мм0,48 мм160 г/м2.Кол-восеребраВремянапыленияВ составеповиаргола0,35г/м2.1,10 г/м230 сек30 сек2.3 Техника выполнения оперативного вмешательстваВо всех сериях экспериментальной части исследования с целью изученияреакции соединительной ткани на имплантацию сравниваемых эндопротезов,лабораторным животным проводили эндопротезированиепередней брюшнойстенки по методу onlay.
После внутрибрюшинного введения крысам 20% растворахлоралгидрата в дозе 200 мкл/100 граммов веса животного в условияхоперационного блока кафедры оперативной хирургии и топографическойанатомииим. А.Д. Мясникова ГБОУ ВПО «Курскийгосударственныймедицинский университет» Минздрава России.
Операционное поле двукратнообрабатывали 1% раствором йодопирона, однократно – 95% раствором этиловогоспирта и укрывали стерильным операционным бельём. Далее, животнымпроводили рассечение кожи и подкожно - жировой клетчатки по средней линииживота в верхней трети длиной 4 см. В стороны отсепаровывали кожу иподкожно-жировую клетчатку от апоневроза прямых мышц. Тупо выделялиучасток апоневроза прямых мышц живота размером 4х4 см (рисунок 2).36Рисунок 2 - Фотография этапа эндопротезирования передней брюшнойстенки - выделение участка апоневроза прямых мышц животаК этому участку узловыми швами мононитью 2/0 фиксировали сетчатыйэндопротез размером 2×2 см.
Эндопротез подшивали со всех сторон отдельнымиузловыми швами (рисунок 3).Рисунок 3 - Фотография этапа эндопротезирования передней брюшнойстенки - подшивание эндопротеза37В первой группе эксперимента операционную рану ушивали послойно,наглухо и обрабатывали ее антисептиками (рисунок 4).Рисунок 4 - Фотография этапа эндопротезирования передней брюшнойстенки - ушивание кожи и подкожно-жировой клетчаткиВо второй группе эксперимента, для создания условий микробнойобсемененности в послеоперационную рану вводили 1 мл физиологическогораствора, содержащий 1 млрд.
взвесь микробных тел суточной культурыStaphylococcus aureus 592 и Е. coli. После этого кожу и подкожно-жировуюклетчатку так же наглухо ушивали (рисунок 5).38Рисунок 5 - Фотография этапа эндопротезирования передней брюшнойстенки - создание инфицированных условийОперативные вмешательства выполняли в вечернее время суток в течение 2недель. Животных выводили из эксперимента на 3.
7, 14, 21, и 30 сутки путемпередозировки средств для наркоза.2.4 Морфологические и морфометрические методы исследованияИз центральной части брюшной стенки иссекали фрагмент вместе симплантированными в неё образцами эндопротезов с окружающими их тканямиразмером 2,0x2,0 см. Полученный биологический материал фиксировали в 10%растворе нейтрального формалина. После фиксации, иссекали меньшие кусочкитканей с фрагментами имплантированных эндопротезов и после промывки,обезвоживанияипропитыванияпарафиномпостандартнойметодике,микротомировали.
Срезы, толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином иэозином, по методу Ван Гизон, по Маллори, Шик-реакция с докраскойальциановый синий.Микроскопирование и микрофотосъёмку проводили с помощью оптическойсистемы, состоящей из микроскопа Leica CME и окуляр-камеры DCM - 510 на39увеличениях х40, х100, х200и х400 крат с документированием снимков впрограмме FUTURE WINJOE, входящей в комплект поставки окуляр-камеры.На микрофотографиях оценивали площадь воспалительно-клеточногоинфильтрата вокруг нитей эндопротезов, строение соединительнотканнойкапсулы, наличие и выраженность ее слоев, степень зрелости коллагеновыхволокон и толщину (рисунок 6).Рисунок 6 - Определение площади инфильтрата вокруг нитей эндопротезас помощью программы FUTURE WINJOEТак же исследовали состав клеточного слоя капсулы, непосредственноприлегающегокнитямэндопротеза.Покариологическимпризнакамдифференцировали клетки волокнистой соединительной ткани. Процентноесоотношение указанных представителей клеточной популяции рассчитывалипосле подсчёта 100 клеток в нескольких непересекающихся полях зрения (неменее 10).
[1].С целью объективного сравнения реакции соединительной ткани наиспользуемые материалы, исходя из роли отдельных клеточных элементов враневом процессе по М.И. Кузину и В.В. Серову вычисляли клеточный индекс,представляющий собой отношение клеток гистиоцитарного ряда (клеток-40резидентов) к клеткам воспалительного инфильтрата (клеткам-нерезидентам) последующей формуле:К.И.=где: К.И. – клеточный индекс,К.р. – клетки-резиденты: общее количество макрофагов, фибробластови фиброцитов;К.р.–клетки-нерезиденты:общееколичествогранулоцитов,агранулоцитов и тучных клеток в клеточном слое капсулы.При значении клеточного индекса <1 делали вывод о преобладаниивоспалительных изменений, характерных для I фазы течения раневого процесса,при значении >1 дели вывод о преобладании репаративных тенденций,характерных для II фазы по М.И.
Кузину [7].Для определения индекса дегрануляции тучных клеток на цифровыхмикрофотографиях в 10 стандартных полях зрения проводили подсчет тучныхклеток в грануляционной ткани, формирующейся вокруг эндопротеза, определялисоотношение разных типов тучных клеток (Линдер, 1976) [58].
Определялииндексдегрануляцииусловныхединицахкакотношениеколичествадегранулированных клеток к их общему числу тучных клеток:ИД = ((А×0)+(Б×1)+(В×2)+(Г×3))/nгде: ИД – индекс дегрануляции;А – число недегранулирующих клеток (Т0);Б – слабодегранулирующие тучные клетки, (Т1);В – клетки с умеренной степенью дегрануляции, (Т2);Г – клетки с сильной степенью дегрануляции, (Т3);n – общее число тучных клеток.Отдельно проводили подсчет количества гигантских многоядерых клеток встандартном поле зрения. Учитывали размеры клеток, количество ядер и ихрасположениев цитоплазме.Для изученияфункциональнойактивности41гигантских многоядерых клеток нами был предложен интегральный индекс,который вычисляли по следующей формуле:ИГМК.= ГМКср× яГМКсргде: ИГМК.
– интегральный индекс,ГМКср – среднее количество гигантских многоядерных клеток настандартную площадь среза;яГМКср – среднее количество ядер гигантских многоядерных клеток2.5 Иммуногистохимическое исследованиеИммуногистохимические исследования проводили в соответствии состандартнымипротоколами.Препаратыдляиммуногистохимическогоисследования готовили из имеющихся парафиновых блоков. С помощьюмикротома Leica SM 2000R (Sliding Microtome for Routine Applications)изготавливали срезы, толщиной 4 мкм (Dabbs), которые расправляли на водянойбане Гистобат Leica HII210, помещали на стекло, покрытое L-полилизином, ивысушивали в термостате при температуре 37°С в течение 2 часов.
Затем срезыдепарафинировали в двух о-ксилолах по 5 мин в каждом, отмывали иобезвоживали в четырёх 96% спиртах по 5 мин в каждом. Блокада эндогеннойпероксидазы осуществляли охлажденным 3% раствором Н2О2 на протяжении 10мин. С целью восстановления клеточной антигенной структуры, после фиксациив формалине и заключения в парафин материала в течение 20 мингистологические срезы выдерживали на водяной бане в 0,01 М цитратномбуферном растворе (рН 6,0) при 95 ºС. Инкубацию с первичными антителами Ki67 проводили при комнатной температуре в течение часа. Для визуализациипродуктовиммуннойреакциииспользовалистрептавидин-биотиновыйпероксидазный метод («Dako», LSAB+Kit, HRP), в качестве красящегосоединения применяли раствор диаминобензидина(«Dako», Liguid DAB+),окраску ядер осуществлялась гематоксилином.
В качестве негативного контроляиспользовали срезы, на которые наносили вторичные антитела без нанесенияпервичных антител. Положительной экспрессией белка Ki-67, считалось наличие42специфической коричневой окраски ядер фибробластов. Индекс Ki-67 вычисляликак соотношение количества специфически окрашенных ядер фибробластов кколичеству всех фибробластов 10 полях зрения и выражали в процентах.2.6 Микробиологическое исследованиеДляопределенияколичественногосоставамикрофлорыранупредварительно обрабатывали изотоническим раствором натрия хлорида, затем70 % этиловым спиртом с целью удаления с ее поверхности вегетирующеймикрофлоры. Иссекали участок ткани на всю глубину стерильным лезвиембритвы. Биоптат, с соблюдением правил бактериологической стерильности,помещали в стерильный флакончик, содержащий 1 мл изотонического растворанатрия хлорида (для предотвращения подсыхания и прилипания биоптата кстенке),ивспециальномтермостате(37°С)транспортироваливбактериологическую лабораторию (в течение 1-го часа).
В лаборатории биоптатвзвешивали в условиях бокса на торсионных весах в стерильной кювете, массубиоптата регистрировали, вычисляли коэффициент пересчета на 1 г ткани – «К».Взвешенный биоптат растирали в стерильной ступке и суспензировали визотоническом растворе натрия хлорида из расчета 1:10 с учетом 1 мл«транспортного» изотонического раствора. После десятикратного разведениясуспензии в изотоническом растворе натрия хлорида до 10-3,из каждогоразведения проводили посев 0,1 мл на поверхность плотной питательной среды,разлитой в чашки Петри.Для получения роста изолированных колоний материал тщательно втиралишпателем на питательную среду, в качестве которой использовали сахарный агар.Посевы инкубировали в термостате (37°С) в течение 18 – 20 ч, затем 1 сутки прикомнатной температуре, после чего проводили подсчет колоний, выросших вчашке Петри, и пересчет на 1 г ткани.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
