Диссертация (1140388), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Моделирование катетер-ассоциированной инфекции в экспериментеЖивотные были разделены на три группы: мыши без иммуносупрессии(первая группа), мыши с иммуносупрессией циклофосфамидом (вторая группа) и43иммуносупрессированные мыши с изучением антибактериальных эффектовварнерина (третья группа).Наркотизированным животным (20% раствор Ксилазина «Interchemie»Нидерланды 0,15 мл/кг веса) сбривали шерсть на участке спины и глазнымскальпелем делали прокол кожи. В образовавшийся раневой канал под кожуимплантировали фрагменты пластиковых катетеров длиной 1.0 см и кожныедефекты заклеивали медицинским клеем БФ-2.
В зависимости от видапредварительной обработки фрагментов катетеров животных в каждой группеделили на подгруппы.Первойподгруппеживотныхимплантироваликатетеров. Второй подгруппе мышей предварительносформированныминаотрезкистерильныхвводили отрезки катетеров снихбиопленкамиStaphylococcusepidermidis 33, полученными инкубацией катетеров в суспензиях этих бактерий(109 КОЕ/мл) в течение 48 ч при 37°C. Третьей подгруппе животных вводилиотрезки стерильных катетеров с последующим однократным подкожныминокулированием в операционную рану 0,5 мл суспензии бактерий Staphylococcusepidermidis 33, содержащей 109 КОЕ/мл. Четвертой подгруппе мышей - отрезкистерильных катетеров с последующим ежесуточным в течение трех днейвведением в операционную рану 0,5 мл бактериальной суспензии той жеконцентрации.Объектами морфологических исследований являлись участки мягких тканейвобластиимплантацииотрезковкатетеров.Заборматериаладлягистологического исследования производили в конце первых, вторых и третьихсуток экспериментов.2.3.1.Определениедозыциклофосфамида,вызывающегоиммуносупрессивное действиеПодбор дозы циклофосфамида для формирования иммуносупрессивногосостояния у животных осуществляли на 8 мышах.
В качестве источника44циклофосфамидабылиспользованпрепарат«Циклофосфан-ЛЭНС»быстрорастворимый («Veropharm», Россия). Содержимое ампулы – 200 мглиофилизированного порошка циклофосфамида растворяли в 0,9% растворенатрия хлорида в концентрации 20 мг/1 мл и вводили мышам внутримышечно вдозах 100, 150 и 200 мг/кг. На шестые сутки после начала введения животныхвыводили из эксперимента и проводили измерение соотношения веса тимуса ивеса самого животного. Исходя из полученных данных, наибольшее изменениевеса вилочковой железы регистрировалось при введении максимальной изиспользованных доз иммунодепрессанта.2.3.2.Моделированиекатетер-ассоциированнойинфекциинаиммуносупрессированных животныхАнализ патоморфологических реакций тканей при катетер-ассоциированнойинфекции на фоне развития иммуносупрессии проводили после 5 суточноговведения иммунодепрессанта животным (27 мышей) в дозе 200 мг/кг, а затемпроводили манипуляции аналогичные описанным выше с разделением на такиеже группы.Объектами морфологических исследований являлись участки мягких тканейвобласти имплантации отрезков катетеров.
Забор материала для гистологическогоисследованияпроизводиливконцепервых,вторыхитретьихсутокэкспериментов.2.3.3.Моделированиекатетер-ассоциированнойинфекцииуиммуносупрессированных животных при действии низкомолекулярногокатионного пептида варнерина.В специальной серии экспериментов (24 мыши) морфологическую картинумодели катетер-ассоциированной инфекции изучали в условиях иммуносупрессиина фоне введения животным низкомолекулярного катионного пептида варнерина.45С этой целью использовали препарат пептида варнерина серии 54(лабораториябиохимииразвитиямикроорганизмовИЭГМУроРАН)сактивностью 512 тысяч условных единиц (128 мг/мл).
Часть катетеров подвергалипредварительной обработке варнерином путем их помещения в раствор пептидана 60 минут, а затем катетеры переносили в стерильную чашку Петри ивысушивали под ультрафиолетом (Микроцид, Россия). Указанную процедуруповторяли 5 раз, после чего отрезки катетеров имплантировали животным подкожу спины в той же зоне. В зависимости от особенностей предварительнойобработки отрезков катетеров и способа применения варнерина животные былиразделены на четыре подгруппы.Части животных первой подгруппы имплантировали стерильные отрезкикатетеров, предварительно обработанные варнерином, а остальным животным –отрезки стерильных катетеров с введением в зону имплантации 1 мл стерильноговодного раствора препарата пептида.
Животным второй подгруппы подкожновводили отрезки катетеров со сформированными на них in vitro биопленками S.epidermidis 33 и в те же зоны ежесуточно вводили стерильный водный растворварнерина в количестве 1 мл. В третьей подгруппе животным вводилипредварительно обработанные пептидом отрезки стерильных катетеров, споследующимоднократныминокулированиемвоперационнуюранубактериальных суспензий в количестве – 0.5 мл (109 КОЕ/мл).
Животнымчетвертой подгруппы вводили отрезки стерильных катетеров с последующимежесуточным инъекцированием в операционные раны суспензий бактерий S.epidermidis 33 в количестве 0.5 мл и одновременно в эту же зону ежесуточновводили раствор варнерина в количестве 1 мл.Объектами морфологических исследований являлись участки мягких тканейвобластиимплантацииотрезковкатетеров.Заборматериаладлягистологического исследования производили в конце первых, вторых и третьихсуток экспериментов.46Схема моделирования катетер-ассоциированной инфекциибелых лабораторных мышейИзучение процесса биопленкообразования на венозных катетерахПервая группаИнтактные животныеПодгруппа 1Имплантациястерильныхкатетеровn=3Подгруппа 2Имплантациякатетеров сбиопленкамиn=6Подгруппа 3Однократноевведение взвесибактерий в областьимплантацииотрезка катетераn=6Подгруппа 4Ежесуточное(3 суток) введениевзвеси бактерий вобласть имплантацииотрезка катетераn=4Определение дозы циклофосфамида, вызывающего иммуносупрессию n=8Вторая группаЖивотные с иммуносупрессиейПодгруппа 1Имплантациястерильныхкатетеровn=9Подгруппа 2Имплантациякатетеров сбиопленкамиn=6Подгруппа 3Однократноевведение взвесибактерий в областьимплантацииотрезка катетераn=6Подгруппа 4Ежесуточное(3 суток) введениевзвеси бактерий вобласть имплантациистерильного катетераn=6Третья группаЖивотные с иммуносупрессией и применением варнеринаПодгруппа 1Введение животнымотрезков катетеровпредобработанныхварнерином (а) ивведение варнеринамышам в областьимплантации отрезковстерильных катетеров(б)n=6Подгруппа 2Ежесуточноевведениеварнерина в зонуимплантациикатетеров,инфицированныхбактериальнымипленкамиn=6Подгруппа 3Однократноевведение мышамвзвеси бактерий взону имплантациипредобработанныхварнериномкатетеровn=6Подгруппа 4Ежесуточное(3 суток)введение взвесибактерий иварнерина вобластьимплантациистерильногокатетераn=6472.4.
Морфологические методы исследованияМорфологические исследования выполнены на кафедре патологическойанатомии с секционным курсом ГБОУ ВПО Пермская государственнаямедицинская академия им. ак. Е.А.Вагнера (зав. кафедрой – доктор медицинскихнаук, профессор Г.Г. Фрейнд). Объектами морфологических исследованийявлялись участки мягких тканей в области имплантации отрезков катетеров.Ткани, извлеченные из зон локализации имплантированных отрезковкатетеров, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 ч.Далее материал обезвоживали, обезжиривали и заливали в парафин вгистологическом автомате по общепринятой методике [2].
С парафиновых блоковготовили срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином,пикрофуксином по ван Гизону, по Броун-Хоппсу и основным коричневым поШубичу (табл. 2). Для окрашивания микропрепаратов применяли растворыкрасителей,приготовленныевсоответствиисрекомендациямипогистологической технике [36].Таблица 2Гистологические методы светооптического исследования тканей вокруг отрезковкатетеровМетодики окраскиВыявляемые структурыКоличество препаратовГематоксилин и эозинОбзорная микроскопия78Пикрофуксин по ван ГизонуКоллагеновые волокна27По Броун-ХоппсуОсновным коричневым поШубичуСкоплениямикроорганизмовТучные клетки101048Гистологические препараты изучали на световом микроскопе AxioimagerA1 («ZEISS», Германия). На готовых гистологических срезах оценивали общуюморфологическую картину.Для иммуногистохимических исследований тканевые образцы фиксировалив 10% растворе нейтрального забуференного формалина в течение 18-24 часов,заливаливпарафинпообщепринятымметодикам,азатемготовилигистологические срезы толщиной 4-5 мкм.
Срезы помещали на покрытые силаномпредметныестекла(«DAKO»,Дания),тщательновысушивали,депарафинировали, обезвоживали и отмывали в растворе трис-буфера при pH 7,27,4.Использованныевисследованияхмоноклональныеантителабылипредназначены для работы с парафиновыми срезами. Вариант обработкидепарафинированных срезов выбирали в зависимости от вида моноклональныхантител с учетом инструкций фирмы-производителя. С целью восстановленияструктуры антигенных детерминант на поверхности клеток, изменившихся впроцессе фиксации ткани, гистологические срезы подвергали термическойобработке при кипячении на водяной бане на протяжении 1 часа в цитратномбуферном растворе, pH 6,0. После отмывки в буфере наносили пероксидазныйблок в течение 5 минут, затем вновь промывали в буфере и на препаратынаносили моноклональные антитела.Для иммунного окрашивания использовали стрептавидин-биотиновыйпероксидазныйметодисоответствующийнабордетекции(«DiagnosticBioSystems», USA).
Срезы инкубировали во влажной камере 60 минут притемпературе 37°C с моноклональными антителами к рецепторам клеток эндотелия(CD34), виментину (Vimentin), рецепторам макрофагов (CD68), рецепторам Tлимфоцитов(CD3)ирецепторамB-лимфоцитов(CD20).Данныеобиспользованных антителах и количестве выполненных иммуногистохимическихисследованиях представлены в таблице 3 и 4.49В качестве хромогена использовали тетрахлорид 3,3-диаминобендидина,входящий в вышеуказанный набор детекции. Во всех случаях в течение 0,5-2минутпроводилидокрашиваниеядерклетокгематоксилиномМайера.Контрольные реакции выполняли без первичных специфических антител.При исследовании препаратов на светооптическом уровне антигенпозитивные клетки идентифицировали по их коричневому окрашиванию.В связи с особенностями исследуемого материала (воспалительныйинфильтратитканьиммуногистохимическоговокругпластиковогоисследованиякатетера)оценивалисьрезультатыполуколичественнымметодом на основании наличия или отсутствия положительной окраскисоответствующих клеточных элементов инфильтрата и тканей вокруг катетера.Так, положительный результат оценивали знаком «+», отрицательный знаком «-»,промежуточный «+/-».Просмотр и фотографирование микропрепаратов проводили на микроскопеAxioimager A1 («ZEISS», Германия) с использованием цифровой фотокамерыAxiocam MRc5 («ZEISS», Германия).Таблица 3Панель антител, использованных в иммуногистохимических исследованияхМКАТКлонРабочее разведениеФирма изготовительCD3PS1Ready-to-use«Diagnostic BioSystems», USACD20L26Ready-to-use«Diagnostic BioSystems», USACD68KP1Ready-to-use«Diagnostic BioSystems», USACD34QBEND/10Ready-to-use«Diagnostic BioSystems», USAVimentinSP20 MAbReady-to-use«Spring Bioscience» USA50Таблица 4Количество выполненных иммуногистохимических исследованийМКАТПервая группа –интактныеживотныеВторая группа –животные симмуносупрессиейТретья группа животные симмуносупрессией иприменениемварнеринаCD3589CD20589CD68369CD34589Vimentin5892.5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
