Диссертация (1140388), страница 7
Текст из файла (страница 7)
В37опытах in vitro установлено, что другие бактериальные АБП (Рер5 и эпидермин)при предобработке ими поверхностей силиконовых катетеров существеннозамедляют образование биопленок S. epidermidis, а при действии пептидов насвязавшиеся бактерии количество жизнеспособных клеток значительно снижается[61]. Получены и другие данные об эффективности покрытия на основе АБП впредотвращении бактериальной адгезии на различных полимерных поверхностях[91, 133], а так же на поверхностях титана и их производных [47, 175].Существует мнение, что низкомолекулярные катионные пептиды могутзаменить традиционные антибиотики в качестве эффективных природныхлечебных факторов [146, 147, 216].
Таким образом, разнообразие механизмовдействия катионных пептидов и их способность уничтожать медленно растущие ипокоящиеся клетки, которые преобладают в биопленках, а так же синергизмдействия АБП с некоторыми антибиотиками делает их привлекательнымисоединениями при изучении новых подходов к подавлению биопленок.1.12.
Низкомолекулярный катионный пептид варнеринВ лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии игенетикимикроорганизмовУрО РАН выделенштаммграмположительныхкокков, который был идентифицирован и депонирован как Staphylococcus warneriIEGMKL-1- продуцент низкомолекулярногопептидногосоединения,названного варнерином. Варнерин представляет собой поликатионный пептид,молекулярная масса которого составляет 2999 Da.
Наличие в его составеаминокислоты лантионина позволяет рассматривать варнерин как новый пептидсемейства лантибиотиков. Ранее проведенные исследования свидетельствуют оспособностиэтогонизкомолекулярногокатионногопептида,оказыватьсущественное влияние на физиологию биопленок, образуемых бактериямиS.epidermidis [26]. Известно, что интенсивность формирования биопленок вомногом зависит от свойств материала атакуемых бактериями поверхностей. Изапробированных материалов наиболее пригодной для изучения формирования38биопленок бактериями S. epidermidis 33 оказалась поверхность силикона,интенсивность образования пленки на которойпревышала таковую наповерхностях полистирола и поливинилхлорида, соответственно в 2,5 и 12 раз.
Вэкспериментах выявлено, что динамика развития биопленок во многомнапоминает динамику роста планктонных культур бактерий. При этом наповерхностях полистирола и поливинилхлорида в первые 4-5 суток происходитпрактически линейное увеличение клеточной массы биопленок, котороесменяется быстрым падением до 1/3 от достигнутого максимума [24]. Насиликоновых катетерах хорошо прослеживаются все основные стадии ростабиопленок, наблюдаемые при формировании жидких культур, с постепеннымпереходом в стационарное состояние и медленным небольшим снижениемчисленности клеток на последних сроках наблюдений.
Эти данные, по-видимому,отражают различный уровень реализации внутрипопуляционных механизмоврегуляции численности бактерий в биопленках при колонизации отличающихсяпо физико-химическим свойствам поверхностей. Известно, что существеннуючасть матрикса биопленок составляют различные полиуглеводные соединения, втом числе глюкозаминогликаны. В связи с этим представляют интерес данные,полученные при исследовании действия гликаназ на образование и развитиебиопленок [7].
Все использованные в работе ферменты этой группы оказывалиингибирующее действие на развитие биопленок: менее выраженное на стадииформирования и значительное - на более поздних этапах роста пленок. Наиболееактивное ингибирование развития сформировавшихся пленок обнаружено прииспользованиихитиназы,по-видимому,неспецифическигидролизующейаминоацетильные группировки имеющихся в матриксе биопленок и клеточныхстенках бактерий глюкозаминогликанов и, тем самым, разрушающей строму ибактериальные компоненты биопленок с одновременным повышением в нихуровня катионных аминопроизводных углеводов.
В специальных экспериментахin vitro были получены первые результаты относительно ингибирующегодействия на формирование биопленок низкомолекулярного катионного пептида39варнерина, синтезируемого бактериями Staphylococcus warneri KL-1 [131].Подавляющий эффект пептида проявлялся как на стадии образования, так и насформированных пленках в концентрациях, превышающих минимальнуюингибирующую концентрацию для планктонной культуры. Имеющиеся данныесвидетельствует о реальных перспективах усиления антибиопленочных эффектовпептидного фактора варнерина при сочетании его действия с гликаназами идругими известными антибиотическими факторами [25].1.13.
ЗаключениеВ настоящее время установлено, что практически все микроорганизмы вестественных и искусственно созданных средах существуют в виде сообществ –микробных биопленках, в которых клетки окружены особым, насыщеннымразличными соединениями и структурами, матриксом [46, 90]. Известно, чтобиопленки являются главным фактором контаминации различных протезныхустройств, катетеров, глазных линз и т.д.
[72]Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что на установленныхкатетерах бактериальные пленки образуются не только на внешней его стороне,но и в области просвета катетера [98, 167]. Поскольку катетер находится в прямомконтакте с кровяным руслом, его внутренняя поверхность покрываетсяформенными элементами крови и белками (альбумин, фибриноген), чтозначительно облегчает адгезию микроорганизмов и формирование на нейбиопленок [72].При разработке методов предупреждения формирования и персестированиябактериальных пленок целесообразно использование экспериментальных моделейкатетер-ассоциированныхинфекций.Известно,чтоособеннотяжелоинфекционные процессы протекают на фоне иммуносупрессии, поэтому важнопроведение таких исследований на фоне подавления иммунных реакцийорганизма,которое,вчастности,можетбытьвызвановведением40циклофосфамида,важнейшимэффектомкоторогоявляетсяразвитиенейтропении [63].Моделированиекатетер-ассоциированнойинфекциичащевсегоосуществляется на мышах, реже на крысах.
К настоящему времени предложеномножество способов моделирования катетер-ассоциированной инфекции вразличных модификациях. Обычно отрезки катетеров вживляются подкожно вобласть спины, боковой поверхности брюшка или даже внутрибрюшинно [74,134, 173, 181]. При этом возникают типичные тканевые реакции на повреждение,инородное тело, а также бактериальные биопленки [33, 65]. Представленноесвидетельствует о том, что выраженая резистентность клеточных компонентовбиопленок к антибиотикам требует поиска новых, альтернативных широкоиспользуемым антибактериальным препаратам соединений, способных подавлятьформирование и функционирование бактериальных пленок [152].Кстратегиямподавленияобразованиябиопленокможноотнестиингибирование первого этапа их формирования – бактериального прикрепления иколонизацииимплантатовзасчетиспользованиябиоматериалов,импрегнированных антимикробными агентами, среди которых в качествеперспективных рассматриваются низкомолекулярные катионные пептиды [123].
Вэтой связи особое внимание уделяется группе низкомолекулярных катионныхпептидов семейства лантибиотиков [25, 86].В специальныхэкспериментах былиполучены первые результатыотносительно ингибирующих эффектов низкомолекулярного катионного пептидаварнерина, синтезируемого бактериями Staphylococcus warneri KL-1, которые invitro проявлялись как на стадиях образования, так и на пленках [131].Патоморфологические исследования действия варнерина на моделях катетерассоциированной инфекции явились задачей настоящей работы.41ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1.
Лабораторные животныеИсследование одобрено локальным этическим комитетом Пермскогогосударственного медицинского университета им. ак. Е.А. Вагнера (протокол №3от 25.03.15). Исследования выполнены на 88 самцах белых беспородных мышеймассой 25-30 г. Животных содержали в виварии Института экологии и генетикимикроорганизмов Уральского отделения РАН1 в стандартных условиях вметаллических клетках по одной особи, при естественном освещении, награнулированном корме и при обычном питьевом режиме. Животных выводилииз эксперимента путем передозировки эфирного наркоза.Все манипуляции с лабораторными животными проводили в соответствии справилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночныхживотных, используемых для экспериментальных и иных научных целей(Страсбург, 1986).2.2. Изучение процесса образования биопленок на венозных катетерахПроцесс образования биопленок Staphylococcus epidermidis 33 был изученна венозных тефлоновых катетерах различных фирм: 1 – Pentaferte Teramo(Италия), 2 – Capitole sanitex (Швейцария), 3 – Apexmed international(Нидерланды), 4 – KDM KD-FLY (Германия) и 5 – Ситек Сервис (Россия).Перед использованием в экспериментах фрагменты катетеров длиной 1 смавтоклавировалипри 1 атм.
(121 °C) в течение 1 ч в стеклянныхзавинчивающихся флаконах. Затем в опытные пробы к стерильным катетерамдобавляли по 2 мл инокулума бактерий S. epidermidis 33 в среде LB, содержащего107 КОЕ/мл и инкубировали в течение 24, 48 и 72 ч при 37 °C без сменыпитательной среды. В контрольных пробах отрезки катетеров инкубировали в тойже стерильной питательной среде. По истечении сроков инкубации контрольныеВыражаю благодарность старшему научном сотруднику лаборатории биохимии развитиямикроорганизмов института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАНк.м.н. Л.М.
Лемкиной за организацию и помощь в проведении экспериментов на животных142и опытные отрезки катетеров дважды промывали 4 мл 10 мМ фосфатного буфера(pH 7.2), переносили в стерильные емкости и окрашивали, либо водорастворимымтетразолием (MTS) по процедуре фирмы - изготовителя (Promega, США) дляопределения количества жизнеспособных клеток в образовавшихся биопленках,либо0,1%растворомгенцианвиолета(GV)споследующейспиртовойэкстракцией связавшегося с катетерами красителя и фотометрией экстрактов при570 нм для оценки общей биомассы пленок, включающей в себя все видыбактериальных клеточных элементов и межклеточный матрикс. Результаты пообразованию биопленок S.epidermidis 33 на катетерах разных фирм представленыв таблице 1.Таблица 1Динамика роста биопленок S.epidermidis 33 на различных венозных катетерахВремя ростабиопленокS.epidermidis3324 ч.48 ч.72 ч.1MTSGV0,146±0,010,325±0,020,78±0,060,377±0,041,84±0,131,75±0,11Венозные катетеры234MTSGVMTSGVMTSGVMTSGV0,248±0,010,426±0,030,235±0,020,041±0,000,908±0,080,814±0,071,54±0,111,42±0,101,37±0,100,204±0,011,49±0,110,95±0,070,426±0,031,11±0,10,943±0,071,05±0,082,3±0,191,95±0,170,129±0,010,318±0,020,546±0,040,336±0,021,5±0,111,42±0,115* Данные по таблице представлены в виде OD опыт-OD контроль (OD – оптическая плотность)Из полученных на первых этапах исследований данных было выяснено, чтопроцессы пленкообразования наиболее интенсивно протекают на катетерахфирмы Apexmed international (Нидерланды), что послужило основой выборакатетеров этой фирмы для дальнейших экспериментов на животных.2.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
