Диссертация (1140384), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Существует несколько вариантовтестов с ингибиторами: тест с добавлением ингибитора в среду для определениячувствительности, метод двойных дисков, МБЛ-Е-тест [62, 175, 189]. Тесты сдобавлением ингибитора в среду для определения чувствительности основанына уменьшении МПК карбапенемов у продуцентов карбапенемаз в среде сингибитором [98]. Метод двойных дисков позволяет выявлять изолятыпродуценты карбапенемаз по изменению формы зоны задержки роста вокруг52дисков с кабапенемами вблизи диска с ингибитором. С помощью МБЛ-Е-тестовопределяют наличие МБЛ у тестируемого штамма по уменьшению МПКимипенема на шкале «имипенем + ЭДТА» по сравнению с МПК имипенема нашкале «имипенем». Однако, метод двойных дисков и МБЛ-Е-тест позволяютвыявлять только карбапенемазы класса B.Для проведения CIM-теста (от англ.
«carbapenem inactivation method» методинактивациикарбапенема)тестируемымштаммом,питательнуюсреду,послезасеяннуюдисксинкубациимеропенемомегоконтрольныминкубируютпомещаютнаствердуюкарбапенемчувствительнымштаммом. Результат теста считают положительным в случае наличия ростаконтрольного штамма вокруг диска, что обусловлено инактивацией антибиотикакарбапенемазой тестируемого штамма [214].Чувствительностьиспецифичностьметодовопределениякарбапенемазной активности с помощью бактериологических анализаторовварьирует в широких пределах в зависимости от фирмы-производителя [244].Наиболее достоверный результат дает система BD Phoenix (Becton Dickinson):чувствительность и специфичность определения карбапенемазной активностисоставляют 100% [244].Фенотипические подходы более экономичны и просты, но их выполнениезанимает больше времени.
Они не позволяют расшифровать тип карбапенемазы,а некоторые из них (Ходж-тест) характеризуются большой вероятностьюошибки [175, 227].Аналитические методы выявления карбапенемаз можно разделить на тригруппы:1)электрофоретические(электрофокусирование),2)иммунохимические (иммунохроматография) и 3) основанные на выявлениипродуктов гидролиза карбапенемов (Carba NP-тест, УФ- и масс-спектрометрия).Электрофокусирование-типэлектрофореза,прикоторомбелкиразделяются в зависимости от величины изоэлектрической точки, - один изпервых методов разделения бета-лактамаз [149].
Расположение бета-лактамаз на53гелеопределяетсяприпомощифильтровальнойбумаги,пропитаннойхромогенным цефалоспорином, который при соприкосновении с ферментомподвергается гидролизу и меняет цвет. Дополнительное нанесение на гельЭДТА или клавулановой кислоты позволяет выявить молекулярный классфермента по его чувствительности к соответствующему ингибитору [189].Иммунохроматографическийанализоснованнареакцииантиген-антитело, антигеном является молекула карбапенемазы.
Иммунохроматографиюуспешно применяют для детекции IMP [121]. Данные методы длительны повремени, электрофокусирование не позволяет определить тип карбапенемаз,иммунохроматография информативна лишь для некоторых типов карбапенемаз.Принцип Carba NP-теста основан на изменении цвета кислотно-основногоиндикатора при гидролизе имипенема тестируемым штаммом, позволяетотличить продуцентов карбапенемаз от изолятов с иными бета-лактамазами[167].
С помощью УФ-спектрометрии измеряют степень гидролиза карбапенемав смеси антибиотика с исследуемым штаммом (или очищенными беталактамазами).Наиболеесильныйгидролизимипенемадемонстрируютпродуценты карбапенемазы KPC и NDM [36].Carba NP-тест и УФ-спектрометрия просты в исполнении, но, как ифенотипические подходы, не позволяют расшифровывать тип карбапенемазы.Для выявления у P.
aeruginosa гиперпродукции бета-лактамазы AmpC,участвующей в формировании карбапенемрезистентности в комплексе сдругими механизмами, используют тест с нитроцефином. Нитроцефин –хромогенныйцефалоспорин,гидролизирующийсяподдействиемцефалоспориназ с образованием окрашенного продукта. Количество продуктовгидролиза измеряют с помощью спектрофотометрии [222].Есть мнение, что по-настоящему качественная и быстрая оценкамеханизмов резистентности возможна только при использовании генетическихили протеомных подходов [2]. Способы определения генов бета-лактамазхорошо зарекомендовали себя при воспроизведении на основе мультиплексной54ПЦР и на ДНК-чипах.
Серийно выпускающиеся наборы для мультиплекснойПЦР позволяют находить в чистых культурах и клиническом материале генынаиболее важных карбапенемаз синегнойной палочки – VIM, IMP, NDM, KPC,SPM, SIM, GIM, OXA [11, 18, 211]. Чип-технологии тоже показали себя вкачестве перспективных диагностических систем: испытания чипа «Check-MDRCT103 XL» подтвердили его надежность для определения 23-х генетическихдетерминантрезистентности,кодирующихнаиболееактуальныеESBL,цефалоспориназы и карбапенемазы грамотрицательных оппортунистическихпатогенов, включая P. aeruginosa [40].Выявление эффлюкс- и порин-зависимых механизмов резистентности припомощи генетических методов является более сложным.
Для этого необходимосеквенирование генов, контролирующих структуру и функции поринов иэффлюкс-помп. Реализация таких технологий в условиях больших потоковобразцов в клинической микробиологической лаборатории в ближайшее времякажется неосуществимой. Более перспективными для решения этой задачикажутсяпротеомныетехнологиинаосновемасс-спектрометрии[107].Возможность осуществления структурного анализа поринов и эффлюкс-системP.
aeruginosa на основе матрично-активированной лазерной десорбционноионизационной времяпролетной масс-спектрометрии (МАЛДИ-ВП МС) былареализована почти десять лет назад [109].Весьма интересным является масс-спектрометрическое определениедефектов ЛПС у устойчивых к колистину штаммов [135]. У липида А,экстрагированного из штаммов P. aeruginosa с повышенными МПК колистина,при помощи МАЛДИ-ВП МС (в качестве матрицы использовался норхарман)были обнаружены специфические изменения масс-спектра.Присутствие бета-лактамаз тоже может выявляться при помощи массспектрометрии.Весьмаперспективнымметодомоценкигидролизакарбапенемов является МАЛДИ-ВП МС [116].
Выявление продуцентовкарбапенемаз с помощью масс-спектрометрии основано на оценке пиков,55специфичных для нативных и гидролизированных форм карбапенемов послеинкубации исследуемого штамма с антибиотиком [157]. Процент гидролизарассчитывается по отношению интенсивности пиков продуктов гидролиза кинтенсивности пиков нативного препарата [159].
Способ пробоподготовкиоказывает значительное влияние на результат теста. При использовании вкачестве исследуемого материала белкового экстракта, полученного изизучаемого изолята, чувствительность и специфичность метода достигают100% [159]. В случае исследования бактериальных клеток без предварительнойпроцедурыэкстракциичувствительностьметодасоставляет95%,специфичность - 97% [159]. При воспроизведении методов МС-оценкиактивности карбапенемаз следует учитывать особенности карбапенемов,используемых в реакции в качестве объектов гидролиза. Имипенем позволяетвыявлять все типы карбапенемаз, включая OXA-группу, но дает МС-сигналыслабой интенсивности.
Интенсивность МС-сигналов продуктов гидролизаэртапенема более высокая при наличии у тестируемых штаммов всех типовкарбапенемаз за исключением карбапенемаз группы OXA-48, которые негидролизуют эртапенем в данной тест-системе [159]. Результаты зависят отконцентрации антибиотика в реакционной смеси и времени, требуемого дляполучения надежных результатов. Например, для выявления гидролизаэртапенема в концентрации 10 мг/мл штаммом с карбапенемазой KPC требуется100 мин, а при снижении концентрации до 0,1 мг/мл — всего 30 мин [159].В отношении синегнойной палочки определение карбапенемаз припомощи МАЛДИ-ВП МС оказалось менее воспроизводимым [106].Изложенныйвобзорелитературыматериалсвидетельствуетобисключительной сложности механизмов резистентности у P.
aeruginosa. Тем неменее, проведенный анализ позволяет сделать несколько важных выводов. Вопервых, выбор антибиотикотерапии при синегнойной инфекции должен бытьобоснован с позиции молекулярных механизмов резистентности возбудителя.Во-вторых, существующие способы оценки механизмов резистентности P.56aeruginosa к карбапенемам не соответствуют требованиям современноймедицины. В-третьих, назрела необходимость разработки и внедрения вмикробиологическую практику новыхметодических подходов изученияустойчивости к карбапенемам, основанных на фенотипических, генетических имасс-спектрометрических технологиях.57Глава 2.
Материалы и методы исследования2.1 Штаммы микроорганизмовОбъектами исследования являлись штаммы P. aeruginosa из рабочейколлекции лаборатории микробиологии ФГАУ "Национальный медицинскийисследовательский центр здоровья детей" Минздрава России, собранной втечение 2012 — 2016 гг. Штаммы изолированы от пациентов из 2-х лечебныхучреждений города Москвы по принципу «один пациент — один (первый повремени)изолят».Дляисследованияотбиралиизоляты,обладающиеклинической значимостью: штаммы из стерильных локусов (кровь, моча,ликвор), штаммы из ануса новорожденных (возрастной период от рождения до6 недель), изоляты из локусов с явными клиническими признаками воспаленияприусловииотсутствиядругихмикробныхэтиологическихфактороввоспаления.
Были выбраны все изоляты, нечувствительные к меропенему и/илиимипенему. В качестве критериев нечувствительности для классификацииизолятов использовали значения минимальных подавляющих концентраций(МПК),установленныеКлиническимирекомендациями«Определениечувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (2015 г.) иЕвропейским комитетом по определению чувствительности микроорганизмов кантимикробным препаратам (European Committee on Antimicrobial SusceptibilityTesting, EUCAST, 2018) [5, 80]. Изоляты P. aeruginosa с МПК меропенема более2 мкг/мл и/или с МПК имипенема более 4 мкг/мл считали нечувствительными ккарбапенемам (карба-НЧ). Таким образом, к карба-НЧ изолятам относиликарбапенемрезистентныеизолятыиизолятыспромежуточнойчувствительностью к карбапенемам. Для основной части исследования былотобран51карба-НЧизолят.Дляконтроляванализемеханизмоврезистентности были использованы 9 карбапенемчувствительных (карба-Ч)штаммов (МПК меропенема ≤ 2 мкг/мл и МПК имипенема ≤ 4 мкг/мл),58отобранные в случайном порядке, два штамма из коллекции American TypeCulture Collection (ATCC): P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
