Диссертация (1140384), страница 5
Текст из файла (страница 5)
OprD - это монопротеиновыйпорин. Белок OprD представляет собой мономерную ß-складчатую структуру,состоящую из 18 нитей (S) и 9 петель (L), с массой 45 кДа, кодируется 1332парами нуклеотидов (п. н.). [131, 191, 251]. Его строение впервые было описаноBiswas S. et al. (2007) с помощью рентгеноструктурного анализа [38].Предполагалось, что OprD может функционировать как фермент сериновая протеаза [253]. В более поздних исследованиях показано, чтопозиции, в которых находятся аминокислоты гистидин 156, аспарагин 208,серин 296, необходимые для образования каталитической триады, не позволяютсформировать каталитический центр [38].Петли L3 и L7 формируют сужение в просвете OprD. Остовом суженияявляются 14 аминокислот.29Таблица 2Семейства поринов P. aeruginosa и их субстратыСемейство пориновСубстратOprFНеспецифическийOprBГлюкозаOprGАланин, глицин, серин, валинOprPФосфатыOprOПирофосфатыOccПодсемействоOccDПодсемействоOccKOprD (OccD1)Лизин, гистидин, аргинин, орнитин,меропенем, имипенемOpdC (OccD2)Гистидин, аргининOpdP (OccD3)Глицин-глутамат, аргинин,меропенемOpdT (OccD4)ТирозинOpdI (OccD5), OprQ(OccD6), OpdJ(OccD8)АргининOpdB (OccD7)Пролин, аргининOpdK (OccK1)Ваниллат, бензоат, карбенициллин,цефокситин, тетрациклинOpdF (OccK2)Глюкуронат, карбенициллин,цефокситин, гентамицинOpdO (OccK3)Пироглутамат, цефотаксимOpdL (OccK4)ФенилацетатOpdH (OccK5)Цис-акониат, 3-карбоксилатыOpdD (OccK7)МеропенемШесть из них образуют линию положительного заряда: аргинин 389 илизин 375 - на периплазматической стороне сужения, аргинин 391 и аргинин30410 - в центре сужения, аргинин 30 и аргинин 39 - со стороны внеклеточногопространства(рис.нарастающий1).градиентЭта«аминокислотнаяэлектростатическихлестница»зарядов,поформируеткоторомупротивоположно-заряженные группировки специфического для OprD субстратаскользят из внеклеточной среды в периплазматическое пространство [38].Специфичность пространственно-зарядовой архитектуры субстратов OprDобеспечивается во многом за счет карбоксильной группы, которая необходимадля транспорта молекул через порин [78].ВнеклеточноепространствоПериплазматическоепространствоРисунок 1.
Структура порина OprD P. aeruginosa [38]Приечание. Широкие полосы – нити белка; узкие полосы – петли белка; Arg39, Arg30,Arg410,Arg391,Arg389,Lys375–аминокислоты,формирующиелиниюположительного заряда в «аминокислотной лестнице».Именно из-за наличия карбоксильной группы в транспортируемых через OprDвеществах этот порин и другие каналы этой группы были объединены подобщим наименованием Occ (от англ. «outer membrane carboxylate channels»).Канал OprD обеспечивает проникновение внутрь бактериальной клеткиаминокислот(лизин,гистидин,карбапенемов(меропенем,аргинин,имипенем,орнитин)дорипенемиидр.).антибиотиковЭтотфакт31подтверждается тем, что между перечисленными веществами при иходновременном поступлении в клетку возникает конкуренция.
В присутствииосновных аминокислот проникновение имипенема в клетку существеннозамедляется [230].Регуляция функционирования OprD-канала осуществляется посредствомдвух механизмов: 1) за счет структурных изменений в нуклеотиднойпоследовательности oprD-гена и/или его промотора, 2) через управлениеэкспрессией oprD. Встречаются три типа структурных нарушений оprD-гена. Кпервому относятсямутации,короткие3иделециивключаякороткие1заменыинсерции.Коотдельныхнуклеотидов,второмупринадлежатповреждения гена за счет инсерции мобильных генетических элементов (МГЭ),аименноIS-элементов(отангл.«insertionsequence»-вставочнаяпоследовательность).
Третий тип поломок возникает вследствие реорганизациигенома и включает протяженные делеции и инверсии (более 20 п. н.).Мутации, нарушающие структуру оprD и его промотора приводят кразным функциональным последствиям. Они могут вызывать обрыв синтезааминокислотной последовательности OprD [204]. Сюда можно отнести всеинсерции МГЭ, а также мутации, которые реорганизуют геном, приводят квозникновению стоп-кодонов, сдвигают рамки считывания. Встречаютсямутации, которые не обрывают синтез OprD-протеина, а ведут лишь кизменению его аминокислотной последовательности.
Они могут снижать либоне снижать функцию порина. И тот, и другой случай были неоднократноописаны [59].Самое существенное повреждение гена oprD может быть связано синсерцией в его структуру МГЭ [68, 220, 241]. Наиболее распространеннымвидом МГЭ, обнаруживаемым в oprD-гене, являются IS-элементы с набором1Под короткими делециями и инсерциями понимается соответственно утрата или вставканескольких - до 20 – п. н. [154].32признаков, позволяющих отличать их от других видов МГЭ. К числуотличительных признаков можно отнести: 1) размеры, соответствующиепротяженности от 700 до 3000 п. н., 2) отсутствие структурных генов, заисключением гена транспозазы, которая необходима для перемещения самогоIS-элемента, 3) наличие инвертированных повторов на терминальных участкахIS-элемента и прямых повторов во фланкирующих областях [212].
Взависимости от размера, последовательностей инвертированных и прямыхповторов, особенностей гена транспозазы, IS-элементы подразделяются насемейства. Результатом встраивания вставочной последовательности в геномклетки-хозяина является нарушение экспрессии oprD [242]. Реже oprDповреждается вследствие IS-ассоциированной реорганизации генома. ISассоциированная реорганизация - это протяженные делеции и инверсиипоследовательностиДНК,возникающиевследствиевстраиванияиперемещения IS-элемента в геноме бактериальной клетки.
[27, 130].Отсутствие нарушений в структуре oprD не гарантирует его нормальнойэкспрессии,котораяконтролируетсяразличнымифакторами.Уровеньтранскрипции oprD-гена регулируется системами ArgR и MexT. Аргининзависимый регулятор ArgR способен связываться с оператором гена oprD иповышать его экспрессию (рис. 2). Активность ArgR возрастает в том случае,когда аминокислоты являются единственным источником углерода в среде[170].
Cнижение уровня экспрессии осуществляется регулятором MexT,активирующимся в присутствии салицилата [171]. Ионы металлов снижаютактивность OprD на транскрипционном уровне. Например, цинк и медьдействуют соответственно через регуляторные системы czcSR и copSR (рис. 2)[52; 69]. Молекулы некоторых веществ (например, спермин и спермидин)непосредственно блокируют функционирование OprD [131].33Рисунок 2. Регуляция экспрессии и функции порина OprD P. aeruginosa [131]Примечание. ArgR, copSR, czcSR, parSR, MexT – регуляторы экспрессии oprD; «+» увеличение экспрессии, «-» - снижение экспрессии.
Прямой линией показанаконкуренция основных аминокислот и карбапенемов при проникновении через OprD,изогнутой линией показан прямой блок OprD спермидином и спермином.Эффлюкс-системы, обеспечивающие транспорт антибиотиков уP.aeruginosa, принадлежат к семейству RND (от англ. «resistance-nodulationdivision»). Они функционируют за счет градиента электрохимического(протонного)потенциала[67].RND-системытранспортируютизвнутриклеточной во внешнюю среду антибиотики, красители, детергенты,34дезинфектанты, органические растворители [182]. Эффлюкс-система семействаRND представляет собой трехкомпонентную структуру, элементами которойявляются RND, MFP и OMP [84]. Протеин RND - это компонентцитоплазматической мембраны.
MFP (от англ. «membrane fusion protein» интегративный белок) – периплазматический белок, объединяющий RND иOMP. OMP (от англ. «the outer membrane protein» - белок наружной мембраны) –компонент наружной мембраны. Перечисленные белки формируют канал дляактивного выведения субстрата через периплазматическое пространство инаружную мембрану во внешнюю среду [84].У синегнойной палочки насчитывается 12 видов эффлюкс-систем RND.Ответственными за выведение антибактериальных препаратов являются четыреRND-системы, включая MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN, MexXYOprM (таб.
3). За выведение бета-лактамов отвечают системы MexAB-OprM,MexCD-OprJ, MexXY-OprM [243].Чрезвычайно важной является специфичность MexAB-OprM. MexABOprM может обеспечивать откачку из клеток меропенема, но не имипенема. Этаособенность может объяснить существование штаммов с высокими МПКмеропенема и низкими МПК имипенема, которые довольно-таки частообнаруживаются в практике клинической микробиологии.Фторхинолоны транспортируются через MexAB-OprM, MexCD-OprJ,MexEF-OprN, MexXY-OprM [181]. Эффлюкс аминогликозидов обеспечиваетMexXY-OprM [158] (таб. 3).
Строение эффлюкс-системы MexAB-OprM изученос помощью рентгеноструктурного анализа [24].35Таблица 3Антибиотики-субстраты эффлюкс-систем P. aeruginosaЭффлюкс-система P. aeruginosaАнтибиотик-субстратMexAB-OprMБета-лактамы (в том числекарбапенемы), фторхинолоныMexCD-OprJБета-лактамы, фторхинолоныMexXY-OprMБета-лактамы, фторхинолоны,аминогликозидыMexEF-OprNФторхинолоныКак и все RND-структуры, MexAB-OprM состоит из цитоплазматического(транспортер MexB), периплазматического (MexA) и ассоциированного снаружной мембраной (OprM) компонентов. Самой массивной частью MexABOprM является белок MexA (рис. 3). Он состоит из 13 протомеров, каждыйпротомер включает по три домена. Первый (основной) домен представляетсобой α-спираль, расширяющуюся на одном конце.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
