Диссертация (1140384), страница 20
Текст из файла (страница 20)
21) включаетопределениеуизучаемогоизолятаМБЛ-активностипорезультатамфенотипического исследования с МБЛ-Е-тестами. В случае отсутствия МБЛфенотипа,следуетпровестиколичественнуюцефалоспориназ в тесте с нитроцефином (рис. 21).оценкупродукции131Определение МБЛ-активности изолята(фенотипическое исследование с МБЛ-Е-тестами)Негативный результат.Положительныйрезультат.Основание дляутверждения оналичии МБЛмеханизмаформированиянечувствительности ккарбапенемамИзолят исследуется дополнительно:Выявление гиперактивностицефалоспориназ в тесте с нитроцефиномОтрицательный результат.Основание для утвержденияоб отсутствии беталактамазных механизмовформированиянечувствительности ккарбапенемамПоложительныйрезультат.Основание дляутверждения о наличиимеханизма формированиянечувствительности ккарбапенемам, связанногос гиперпродукциейцефалоспориназРисунок 21.
Упрощенный методический алгоритм выявления бета-лактамаз P.aeruginosa, участвующих в формировании устойчивости к карбапенемамРазвернутый алгоритм осуществляется при помощи трех методическихподходов (рис. 22) и отличается от упрощенного алгоритма тем, чтопредполагает получение информации о генах-детерминантах резистентности вслучаеположительныхрезультатовфенотипическогоопределениякарбапенемаз.На первом этапе следует провести оценку карбапенемазной активностиисследуемого изолята по степени гидролиза меропенема при помощи МАЛДИВП МС.
В зависимости от результатов первого этапа изоляты должны бытьрассортированы на 2 группы: позитивные и негативные.132Оценка карбапенемазной активности изолята по степенигидролиза меропенема при помощи МАЛДИ-ВП МСПоложительныйрезультат.Основание дляутверждения о наличиимеханизманечувствительности ккарбапенемам, связанногос карбапенемазами.Изолят исследуетсядополнительно припомощи генетическихметодов для определениягенов карбапенемаз (blaVIM,blaIMP, blaNDM, blaIMI, blaOXA идр.)Негативный результат.Изолят исследуется дополнительно:Выявление гиперактивностицефалоспориназ в тесте снитроцефиномОтрицательныйрезультат.Положительныйрезультат.Основание дляутверждения об отсутствиибета-лактамазныхмеханизмов формированиянечувствительности ккарбапенемамОснование дляутверждения о наличиимеханизма формированиянечувствительности ккарбапенемам,связанного сгиперпродукциейцефалоспориназРисунок 22.
Развернутый методический алгоритм выявления бета-лактамаз P.aeruginosa, участвующих в формировании устойчивости к карбапенемамПозитивные изоляты следует направить на генетическое исследование,нацеленное на выявление генов-детерминант резистентности (blaVIM, blaIMP,blaNDM, blaIMI, blaOXA и др.). У негативных изолятов следует провестиколичественную оценку продукции цефалоспориназ в тесте с нитроцефином.Выявление bla-генов позволяет не только оптимизировать лечебный процесс,ноиделатьполезныевыводыобэпидемиологическихциркулирующих штаммов синегнойной палочки.свойствах133НарушениепроницаемостипоринаOprDприводиткснижениюпоступления карбапенемов в бактериальную клетку и является одним из частовстречающихся механизмов формирования резистентности к карбапенемам у P.aeruginosa.
Нарушение проницаемости OprD может возникать вследствие двухпричин: 1) мутаций в области гена oprD, которая кодирует «аминокислотнуюлестницу», определяющую транспорт карбапенема через порин; 2) сниженияуровня экспрессии oprD.В настоящем исследовании мутации, ведущие к обрыву синтеза OprD,были обнаружены нами у 86% карба-НЧ изолятов P. aeruginosa. Корреляциимежду длиной синтезированной полипептидной цепи OprD и МПК карбапенемовобнаружено не было. В связи с этим можно предположить, что дистальныйобрыв полипептидной цепи порина блокирует его функцию в такой же степени,как и проксимальный.Отсутствиекорреляцииможетбытьрезультатомнеоднородностивыборки: подавляющее большинство штаммов с мутациями, ведущими к обрывусинтеза OprD (82%), обладали дополнительными механизмами резистентности.Увсехкарба-НЧизолятовбезобрывающихОprDмутацийинепродуцирующих МБЛ и цефалоспориназы, наблюдался пониженный уровеньэкспрессии oprD.
Снижение уровня экспрессии oprD у карба-НЧ изолятов вбольшинстве случаев сочеталось с другими механизмами резистентности.У8карба-НЧизолятовнарушениепроницаемостиOprDбылоединственным механизмом резистентности к карбапенемам. Показатели МПКмеропенема у данных изолятов варьировали от 4 до 16 мкг/мл (Ме = 8 (6; 12)),имипенема – от 2 до 16 мкг/мл (Me = 16 (16; 16). Практически у всех изолятовзначения МПК имипенема превышали значения МПК меропенема. Полученныерезультаты соответствуют данным зарубежных исследователей, в которых числоштаммов с нарушением проницаемости OprD составило от 30 до 90% от всехкарба-НЧ изолятов P.
aeruginosa. При этом значения МПК карбапенемовнаходились на невысоких уровнях (8 – 16 мкг/мл) [200, 204, 241].134НевысокиезначенияМПКкарбапенемовпринечувствительности,обусловленной нарушением проницаемости OprD, свидетельствуют о наличиидополнительных путей поступления карбапенемов в периплазматическоепространство.Вчастности,транспортмеропенемаосуществляютдвадополнительных порина – OpdP и OpdD [60, 216]. В настоящем исследованииобнаружены расхождения между значениями МПК меропенема и имипенема,которые косвенно подтверждают наличие альтернативных путей проникновениямеропенема в клетку P.
aeruginosa. При наличии оprD-инактивации значенияМПК меропенема (Ме = 8) были значительно меньше (p < 0,05), чем значенияМПК имипенема (Ме = 16). Можно предположить, что именно наличиедополнительных поринов обуславливает более низкие МПК меропенема посравнению МПК имипенема в случае, когда порин-зависимый механизм являетсяединственным механизмом резистентности к карбапенемам. Это наблюдениеможет иметь практическую значимость для оптимизации противомикробнойтерапии. Оно говорит о том, что расхождение между МПК меропенема иимипенема в сторону уменьшения МПК меропенема является признаком оprDинактивации.В этихслучаяхиспользованиемеропенема длялечениясинегнойной инфекции предпочтительнее.Всего у 51 карба-НЧ изолята P. aeruginosa было обнаружено 30 различныхструктурных вариантов oprD-гена.
Это подтверждает высокое разнообразиеадаптационных изменений oprD, описанное другими исследователями [179].Самым важным результатом, полученным при исследовании структуры oprD,было открытие новых IS-элементов у синегнойной палочки. Впервые в oprD-генеP. aeruginosa были найдены вставочные элементы ISPsme1 и ISPst2, которыеранее были описаны у Pseudomonas mendocina и Pseudomonas stutzeri,соответственно [42, 221]. IS-элемент ISPa195, обнаруженный в ходе нашегоисследования,неимеетгомологиисизвестнымивставочнымипоследовательностями.
Характеристики нового IS-элемента были внесены в базыданных BioProject (режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/436637)135иIS-finderдоступа:(режимhttps://isfinder.biotoul.fr/scripts/ficheIS.php?name=ISPa195)подномеромMF770250.Данное наблюдение является крайне важным. Способность IS-элементов кгоризонтальному переносу, а, следовательно, распространению oprD-зависимойнечувствительности к карбапенемам среди госпитальных штаммов родаPseudomonas, свидетельствует об эпидемиологической значимости этогомеханизма резистентности. IS-зависимое повреждение гена oprD являетсядостаточно распространенным среди клинических штаммов P. aeruginosa: внастоящем исследовании выявлено, что вставочные элементы в составе oprDобнаруживаются у 25% карба-НЧ изолятов синегнойной палочки.У 55% (28/51) карба-НЧ изолятов была выявлена гиперактивностьэффлюкс-систем. Все изоляты с гиперактивностью эффлюкс-систем имелидополнительныегиперпродукциямеханизмырезистентностицефалоспориназили(продукциянарушениекарбапенемаз,проницаемостиOprD).Сочетание гиперэффлюкса с другими механизмами затрудняет избирательнуюоценку вклада этого механизма в общий уровень карбапенемрезистентности.
Темне менее, эффлюкс-насосы являются важным инструментом реализацииустойчивости к бета-лактамам. Об этом говорят не только литературные данные[58, 188]. Косвенным доказательством роли эффлюкс-помп, полученном внастоящем исследовании, является отсутствие усиления эффлюкс-процессов учувствительных к карбапенемам штаммов.Наиболее частым сочетанием механизмов резистентности, выявленном внашем исследовании, стало сочетание гиперактивности эффлюкс-систем и oprDинактивации. Такое сочетание механизмов было обнаружено у 25% карба-НЧизолятов. В группе штаммов с данными механизмами (13 штаммов) МПКмеропенема и имипенема варьировали в пределах от 4 до 32 мкг/мл.
Вописанныхвобнаруживаласьлитературевкачествеслучаях,когдаединственногогиперактивностьмеханизмаэффлюксарезистентности,136результатом становились более высокие значения МПК меропенема посравнению с МПК имипенема, так как основным субстратом эффлюкс-системыMexAB-OprM является именно меропенем. Однако, как уже было сказано выше,меропенем в отличие от имипенема, поступающего в периплазматическоепространство только через OprD, имеет несколько альтернативных поринов дляпоступления в бактериальную клетку. Вследствие этого наличие нарушенийпорина OprD может нивелировать различия МПК меропенема и имипенема,возникающие в результате гиперактивности эффлюкс-помп.Несколько упрощенным, но весьма наглядным итогом исследования можетстать таблица, отражающая влияние механизмов карбапенемрезистентности наобщий уровень устойчивости к карбапенемам (по значениям МПК), а такжепоказывающая частоту встречаемости указанных механизмов среди карба-НЧизолятов P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
