Диссертация (1140384), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Козлова) [15, 21].Молекулярно-генетическиеграмотрицательныхособенностипатогенностибактерий-продуцентовирезистентностибета-лактамазинтенсивноизучаются в НИИДИ ФМБА России (Санкт-Петербург, научная школа проф.С.В. Сидоренко) [9, 10]. Роль синегнойной палочки и ее резистентных форм вразвитииотдельныхвидовпатологии(нозокомиальныеинфекции,8муковисцидоз,ожоговаяисследовательскихгруппболезнь)ФГБУявляются«ФНИЦЭМим.предметомН.Ф.интересаГамалеи»(подруководством академика А.Л. Гинцбурга), ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии»Роспотребнадзора (руководитель – академик РАН В.Г. Акимкин), ФГБНУ«НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» (руководитель – академик В.В.Зверев), НИИ скорой помощи им.
Н.В. Склифосовского (руководитель –профессор РАН С.С. Петриков), ФГБУ «НМИЦ ССХ им. А.Н. Бакулева»(лаборатория под руководством д.м.н. Д.А. Попова) и других научныхколлективов [6, 12, 13, 20].Приведенная информация свидетельствует о большом интересе научномедицинскогосообществакпроблемерезистентностиP.aeruginosa.Большинство отечественных работ, посвященных роли синегнойной палочки впатологии человека, сконцентрировано на эпидемиологических вопросах, ониописывают лишь общий профиль антибиотикорезистентности клиническихизолятов. Если методы определения общей чувствительности к карбапенемам усинегнойной палочки отработаны до совершенства, то оценка конкретныхмеханизмов резистентности к этой группе представляет большую практическуюпроблему для клинической микробиологии. Это, прежде всего, касаетсяфенотипическихкарбапенемы.«ЭкспертныеметодовопределенияМногочисленныеправилаоценкибета-лактамаз,литературныечувствительностигидролизирующихисточники,включаямикроорганизмовкантимикробным препаратам», указывают, что существующая «оценка уровнейустойчивости к бета-лактамам у штаммов, продуцирующих ESBL иликарбапенемазы, способные расщеплять данные антибиотики, может бытьнедостаточно точной и воспроизводимой, особенно в рутинной практике» [79].Вопросы, связанные с молекулярно-генетическими основами нарушенийтранспорта карбапенемов внутрь бактериальной клетки через мембранныепорины и активацией их эффлюкс-откачки, также являются малоизученныминаправлениями современной медицинской микробиологии.9Цель исследованияЦельисследования–охарактеризоватьмолекулярно-генетическиемеханизмы устойчивости клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa кантибиотикам группы карбапенемов.Задачи исследования1.
Определить цефалоспориназную и карбапенемазную активностьклинических изолятов P. aeruginosa и оценить вклад цефалоспориназ икарбапенемаз в формирование устойчивости к карбапенемам.2. Изучить структурные особенности гена oprD, а также оценитьэкспрессию oprD-генов у карбапенемнечувствительных изолятов P. aeruginosaи проанализировать роль порина OprD в формировании нечувствительности ккарбапенемам.3.ОхарактеризоватьактивностьRND-эффлюкс-системукарбапенемнечувствительных изолятов P. aeruginosa и оценить их роль вформировании устойчивости к карбапенемам.4.Провестианализсочетаниймеханизмоврезистентностиукарбапенемнечувствительных изолятов P. aeruginosa и выявить зависимостьмежду уровнем минимальной подавляющей концентрации карбапенема иналичием механизмов устойчивости к нему.5. Обосновать возможности использования масс-спектрометрии дляоценки карбапенемазной активности клинических изолятов P.
aeruginosa.Научная новизнаВ составе гена oprD карбапенемнечувствительных изолятов P. aeruginosaобнаружены вставочные элементы (IS), которые ранее не встречались у10представителей вида P. aeruginosa. Два типа обнаруженных у P. aeruginosa ISэлементов (ISPsme1 и ISPst2) были описаны ранее у других видов родаPseudomonas, а один тип, ISPa195, был ранее неизвестен. Впервые в Россиипроанализирована роль нарушений структуры порина OprD и экспрессии генаoprD в формировании устойчивости к карбапенемам у клинических изолятов P.aeruginosa.Введеныпонятия,цефалоспориназвпо-новомуразвитиихарактеризующиеустойчивостисинегнойнойзначимостьпалочкиккарбапенемам.
Доказано наличие закономерностей, определяющих высокиеуровни минимальных подавляющих концентраций (МПК) карбапенемов укарбапенемрезистентных штаммов. Доказана возможность использованияматрично-активированнойлазернойдесорбционно-ионизационнойвремяпролетной масс-спектрометрии (МАЛДИ-ВП МС) для достоверноговыявления изолятов P. aeruginosa, продуцирующих карбапенемазы. Впервые вРоссии проанализирована карбапенемазная активность клинических изолятов P.aeruginosa при помощи МАЛДИ-ВП МС.Впервые в России у клинических изолятов P. aeruginosa былапроанализирована активность эффлюкс-зависимого выведения карбапенемов изклетки, и сделаны выводы о роли эффлюкс-систем в формированиикарбапенемрезистентности.Вскрыта значимость влияния разных механизмов устойчивости науровень МПК карбапенемов.Теоретическая и практическая значимость работыРезультаты исследования вносят существенный вклад в изучениемеханизмов устойчивости к карбапенемам у P.
aeruginosa и позволяютполучить представление о существовании отдельных и сочетанных механизмовустойчивости у клинических изолятов P. aeruginosa. В работе научно11обоснована и подтверждена концепция о том, что потеря чувствительности ккарбапенемам у синегнойной палочки в большинстве случаев являетсярезультатом комплексных структурных и/или функциональных изменениймолекулярно-генетическогозакономерности,профиляопределяющиебактериальнойзависимостьклетки.Выявленыинтенсивногогидролизамеропенема от карбапенемаз группы VIM.
Изучены связи между продукциейметалло-бета-лактамаз и максимальным повышением МПК карбапенемов уизолятов P. aeruginosa. Получено представление о многообразии мутаций генаoprD, влияющих на возникновение устойчивости к карбапенемам. Расширеныпредставления о роли вставочных элементов, повреждающих oprD-генсинегнойной палочки, в развитии устойчивости к карбапенемам. Теоретическиобоснован выбор методов оценки роли того или иного механизма вформировании устойчивости к карбапенемам при исследовании клиническихизолятов P.
aeruginosa.Показано, что использованные для решения задач диссертационнойработыметодическиеподходыявляютсяперспективнымидляоценкимеханизмов резистентности в работе научно-исследовательских и клиническихмикробиологическихлабораторий.Успешноадаптировандляизучениясинегнойной палочки и апробирован на клинических изолятах P. aeruginosaмасс-спектрометрическийметодоценкиактивностикарбапенемаз.Установлено, что данные о наличии карбапенемаз, получаемые с помощьюМАЛДИ-ВПМС,соответствуютданным,получаемымтрадиционнымиметодами (генетическим и фенотипическим). Предложен протокол определенияактивности цефалоспориназ у P. aeruginosa с помощью нитроцефина длявыявления штаммов с гиперпродукцией цефалоспориназ.Обнаруженный в ходе исследования новый вставочный элемент ISPa195был зарегистрирован в базах данных GenBank и IS-finder под номеромMF770250, благодаря чему его нуклеотидная последовательность сталареференсным эталоном для поиска аналогичных вставочных элементов.12ОпределеныуровниМПКкарбапенемов,обнаружениекоторыхпритестировании изолята P.
aeruginosa может свидетельствовать о наличии у негоконкретных механизмов устойчивости к карбапенемам.Методология и методы исследованияМетодология организована в соответствии с целью диссертационногоисследования.Объектамирезистентныеaeruginosa,исследования являлиськкарбапенемам.штаммыМинимальныеPseudomonasподавляющиеконцентрации карбапенемов определяли при помощи метода серийныхразведений. Наличие металло-бета-лактамаз выявляли при помощи МБЛ-Етеста (BioMerieux, Франция), наличие генов карбапенемаз и экспрессию генаoprD определяли при помощи полимеразной цепной реакции в реальномвремени.Продукциюцефалоспориназоценивалиприпомощиспектрофотометрии, карбапенемазную активность – при помощи массспектрометрии.
Мутации в гене oprD определяли при помощи секвенированияпо методу Сэнгера. Активность эффлюкс-систем оценивали при помощиингибитора эффлюксных систем - карбонил-цианид-3-хлорфенилгидразона.Статистическую обработку данных проводили при помощи программы SPSS20.0 (SPSS Statistics).Положения, выносимые на защиту1.Гиперпродукциямеханизмамицефалоспориназ,резистентности,ипродукциясочетающаясякарбапенемазсдругимиприводяткформированию высоких уровней устойчивости к карбапенемам у клиническихизолятов P.
aeruginosa. Матрично-активированная лазерная десорбционноионизационная времяпролетная масс-спектрометрия является достоверным13методом ускоренного выявления изолятов P. aeruginosa, продуцирующихкарбапенемазы.2. Генетически детерминированная инактивация порина OprD, являясьраспространеннымкарбапенемам,механизмомобусловленанечувствительностиразнообразнымиP.aeruginosaструктурнымикифункциональными нарушениями oprD-гена. У изолятов P. aeruginosa синактивацией OprD регистрируется более низкий уровень резистентности ккарбапенемам, чем у штаммов, продуцирующих металло-бета-лактамазыгруппы VIM или гиперпродуцирующих цефалоспориназы.3.
Гиперактивность RND-эффлюкс-систем является распространеннымсвойством карбапенемнечувствительных штаммов P. aeruginosa и участвует вформировании нечувствительности к карбапенемам в сочетании с другимимеханизмамиустойчивости,включаяпродукциюметалло-бета-лактамаз,гиперпродукцию цефалоспориназ, нарушения пориновой проницаемости.Личное участие автора в получении результатовЛичное участие соискателя в получении результатов, изложенных вдиссертации,заключалосьвпроведениимикробиологическойчастиисследования (культуральный посев, идентификация и реиндентификациябактерий, определение минимальных подавляющих концентраций меропенемаи имипенема), оценке цефалоспориназной и карбапенемазной активностиизолятов,определенииактивностиэффлюкс-систем,проведениисеквенирования и оценке экспрессии гена oprD у P. aeruginosa в лабораториимикробиологии ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
