Диссертация (1140384), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Chalhoub H. et al. (2016)показали, что при наличии у P. aeruginosa дефектов OprD или гиперактивностиэффлюкс-систем значения МПК карбапенемов колеблются в диапазоне от 4 до64 мкг/мл [58]. Можно предположить, что при наличии у изолята P. aeruginosaкарбапенемаз данные механизмы играют второстепенную роль в формированиинечувствительности к карбапенемам у P.
aeruginosa.Проведенныйстатистическийанализ, направленный на сравнениевлияния отдельных механизмов резистентности P. aeruginosa, а также ихсочетаний, на уровень МПК карбапенемов, позволяет сделать несколько125выводов.Во-первых,механизмырезистентности,присутствующиеуклинических изолятов синегнойной палочки, неодинаково влияют на уровеньМПК карбапенемов для клинических изолятов P. aeruginosa. Во-вторых,продукция синегнойной палочкой карбапенемаз вызывала самое сильноеповышение МПК меропенема и имипенема, независимо от наличия другихмеханизмов резистентности.
В-третьих, вторыми по значимости для повышенияуровня МПК являются сочетания механизмов резистентности, включающиегиперпродукцию цефалоспориназ. В-четвертых, самым часто встречающимсясочетанием механизмов резистентности к карбапенемам является наличиегиперактивности эффлюкс-систем и инактивация oprD.126ЗАКЛЮЧЕНИЕСинегнойная палочка P. aeruginosa – один из самых значимыхоппортунистических патогенов – обладает способностью быстро приобретатьрезистентность ко многим группам антибиотиков [8]. Учитывая факт высокогораспространениярезистентностиP.aeruginosaкфторхинолонам,аминогликозидам и антисинегнойным цефалоспоринам, можно утверждать, чтонаиболее эффективными антибиотиками для лечения синегнойной инфекцииостаются лишь карбапенемы и полимиксины (колистин) [21]. Однако, статистикапоказывает, что среди клинических изолятов P. aeruginosa в последние годысуществует тенденция распространения устойчивости к карбапенемам [55, 199,223]. В связи с этим расшифровка молекулярно-генетических механизмовкарбапенемрезистентностиP.aeruginosa,основаннаянановыхбактериологических, генетических и масс-спектрометрических технологиях,является актуальной задачей современной медицинской науки.В настоящем исследовании были проанализированы бета-лактамазные(продукциякарбапенемазигиперпродукцияцефалоспориназ),порин-зависимые и эффлюкс-зависимые механизмы резистентности P.
aeruginosa ккарбапенемам.Полученные результаты показали, что почти 60% карба-НЧ клиническихизолятовобладаютбета-лактамазнымимеханизмамирезистентностиккарбапенемам, они продуцируют VIM-карбапенемазы или гиперпродуцируютцефалоспориназы.Почти30%карба-НЧизолятовдемонстрируютфенотипические признаки наличия МБЛ.
У каждого из МБЛ-позитивныхизолятов обнаружены гены металло-бета-лактамаз группы VIM (blaVIM-гены).Изоляты, не обладающие blaVIM-генами, фенотипически не проявляют МБЛактивность.Следовательно,устойчивостьккарбапенемам,вызываемаяпродукцией карбапенемаз, связана исключительно с карбапенемазами VIM-типа.В целом наши результаты соответствуют данным, полученным в других127исследованиях. По данным Edelstein et al. (2014) в России в 2011-14 гг.
МБЛпозитивные штаммы P. aeruginosa встречались у 21,3 - 28,3% нозокомиальныхизолятов [15, 21]. В странах СНГ - России, Беларуси и Казахстане - МБЛпозитивные штаммы P. aeruginosa чаще продуцируют карбапенемазу VIM-2(99,6 %), и всего в 0,4 % случаев — IMP [75]. Естественно, что наши выводыявляются корректнымы только для локальных клинических штаммов P.aeruginosa, в отдаленных от России географических регионах возможнациркуляциясинегнойнойкарбапенемрезистентности.палочкиНапример,суинымидетерминантамикарбапенемаза-продуцирующихизолятов P. aeruginosa из стран Азии нередко встречаются blaIMP-гены [211]. ВГермании весьма распространенной является группа генов blaGIM [239]. В странахЮжной и Центральной Америки часто встречаются изоляты P.
aeruginosa,несущие гены blaGES [89, 213]. Согласно общемировой статистике, около 40%карбапенемрезистентных штаммов P. aeruginosa являются продуцентамикарбапенамаз, среди которых чаще встречаются ферменты классов А (KPC) и B(IMP, VIM, NDM) [26, 53, 143, 176, 198, 209].Между наличием у исследуемого изолята VIM-металло-бета-лактамазы ивысокимипоказателямиМПКимипенемаимеропенемаобнаруженаположительная корреляция. Значения МПК меропенема и имипенема уVIM/МБЛ-позитивных штаммов находятся на самых высоких уровнях – от 64(меропенем) и 128 (имипенем) до 512 мкг/мл. Это логично объясняется тем, чтокарбапенемазыVIM-типаобладаюточеньсильнойгидролитическойактивностью в отношении карбапенемов, уступающей в количественномотношениилишьNDM-металло-бета-лактамазам[128].Продукциюкарбапенемаз считают наиболее значимым механизмом в формированиивысоких значений (> 64 мкг/мл) МПК карбапенемов у P.
aeruginosa, при этомштаммы с карбапенемазами встречаются довольно часто и составляют от 30 до40% карба-НЧ изолятов [201]. Полученные результаты соответствуют данныммировой статистики и подтверждают, что карбапенемазы вносят наиболее128значимый вклад в формирование нечувствительности к карбапенемам [197].Важность обнаружения МБЛ-позитивных штаммов обусловлена не тольковысокой степенью их антикарбапенемной активности.
Гены blaVIM являютсяадаптивными,а,горизонтальнойследовательно,передачи-являютсяпризнака.Этогенетическойговоритоосновойнегативномэпидемиологическом значении VIM/МБЛ-позитивных штаммов. Активноевыявление таких штаммов должно стать составной частью работы всехлабораторий клинической микробиологии.Следовательно, в практическом здравоохранении существует потребностьактивного выявления штаммов-продуцентов карбапенемаз.Существует широкий набор методик для выявления штаммов-продуцентовкарбапенемаз. Они включают молекулярные, фенотипические и аналитическиеподходы. МАЛДИ-ВП масс-спектрометрия считается простым, быстрым идостоверным способом детекции бета-лактамазной активности, основанным надетекции продуктов гидролиза антибиотиков-бета-лактамов.
Однако массспектрометрический подход требует тщательного подбора индивидуальныхусловий анализа для разных видов бактерий. Ранее эффективность массспектрометрического обнаружения бета-лактамаз была подтверждена для E. coli,Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, A. baumannii [91]. Для выявленияпродуцентов карбапенемаз с помощью МАЛДИ-ВП МС среди изолятов P.aeruginosa до настоящего времени не было разработано оптимальной методикимасс-спектрометрического анализа.Апробированная в настоящем исследовании методика оригинальнымобразом совместила использование (1) нестандартной матрицы для МАЛДИ-ВПМС, в качестве которой применялась 2,5-дигидросксибензойная кислота, (2)меропенема в качестве антибиотика-индикатора гидролиза и (3) оригинальнойстатистической обработки полученных масс-спектров гидролиза меропенема,которая позволяет избежать ложноположительных и ложноотрицательныхрезультатов.Проведенныеэкспериментыпоказалиполноесоответствие129результатов, полученных при помощи МАЛДИ-ВП МС и посредствомтрадиционных методов (определения наличия генов карбапенемаз и МБЛ-Етеста).
Адаптация масс-спектрометрического способа выявления карбапенемаздля работы с P. aeruginosa важна для клинической микробиологии, так какМАЛДИ-ВП МС имеет ряд преимуществ по сравнению с другими способамиопределения карбапенемазнойактивности. Масс-спектрометрия позволяетбыстрее (за несколько часов), чем молекулярные методы, определить наличиекарбапенемазы у тестируемого штамма. В отличие от фенотипических методов(МБЛ-Е-тест, метод двойных дисков), масс-спектрометрия детектирует любойтип карбапенемазы, в то время как фенотипические методы дают положительныйрезультат только при наличии карбапенемаз определенных молекулярныхклассов и характеризуются большой вероятностью ошибки. Еще однопреимущество масс-спектрометрии заключается в том, что она способна даватьрезультат при работе непосредственно с клиническим материалом без выделениячистойкультуры,Вышеизложенноечтозначительнодоказываетсокращаетперспективностьвремяанализаиспользования[174].масс-спектрометрии для оценки карбапенемазной активности у клинических штаммовP.
aeruginosa.Помимопродукциикарбапенемазбета-лактамазныемеханизмырезистентности к карбапенемам у P. aeruginosa включают гиперпродукциюприродных цефалоспориназ: AmpC и PoxB [197]. Природные цефалоспориназыспособны осуществлять медленный гидролиз карбапенемов. В синергизме сдругими механизмами (нарушение проницаемости OprD и гиперактивностьэффлюкс-систем) – данные ферменты способны вызвать устойчивость ккарбапенемам [188, 257].Количество штаммов с гиперпродукцией цефалоспориназ среди карба-НЧизолятов по данным зарубежных авторов не привышает 40% [201]. В нашемисследовании были получены сопоставимые результаты: число штаммов сгиперпродукцией цефалоспориназ среди карба-НЧ МБЛ-негативных изолятов130составило 42% или 29% от общего числа карба-НЧ изолятов.
Все они обладалидополнительными механизмами резистентности к карбапенемам (нарушениепроницаемости OprD и/или гиперактивность эффлюкс-систем). Между наличиемгиперпродукции цефалоспориназ и уровнями МПК карбапенемов у тестируемыхизолятовобнаруженаположительнаякорреляция.МПКизолятов,гиперпродуцирующих цефалоспориназы, достигали уровней 512 мкг/мл длямеропенемаи256мкг/млдляимипенема.Полученныерезультатысвидетельствуют, что продукция карбапенемаз является не единственнойпричиной формирования высоких уровней МПК карбапенемов. Гиперпродукцияцефалоспориназ при наличии дополнительных механизмов резистентности такжеприводит к увеличению МПК карбапенемов до высоких значений.
Такой выводговорит о необходимости тестирования клинических изолятов P. aeruginosa вотношении цефалоспориназной активности.Результаты исследований позволяют предложить два практическихалгоритма выявления бета-лактамаз P. aeruginosa, участвующих в формированииустойчивости к карбапенемам. Упрощенный вариант (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
