Диссертация (1140384), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Всего среди карба-НЧизолятов обнаружено 49/51 (96%) штаммов oprD-инактивацией (мутации,ведущие к обрыву синтеза OprD, или снижение уровня экспрессии oprD).Значения МПК меропенема данных изолятов регистрировались в диапазоне от 4до 512 мкг/мл (Ме = 32 (8; 256)), имипенема – от 1 до 512 мкг/мл (Ме = 32 (16;256)).98Показатель экспрессии oprD1,5Ме = 1,01,00,5Ме = 0,4Карба-НЧ изолятыКарба-Ч изолятыРисунок 13. Показатели экспрессии oprD у карба-Ч и карба-НЧ изолятов P.aeruginosaБольшинство из них (41/49, 84%) обладали дополнительными механизмаминечувствительности к карбапенемам.
Лишь у 8 исследованных штаммов oprDинактивация была единственным механизмом резистентности к карбапенемам(карбапенемазы,гиперэффлюксигиперпродукцияцефалоспориназотсутствовали). В структуре oprD-гена данных штаммов обнаруживали сдвиграмки считывания вследствие делеции нуклеотидов (nt 602-nt612Δ11 п. н. (уодного штамма) или IS-элементы (ISPa1328 - у 6 штаммов, ISPst2 - у одногоштамма).
МПК меропенема у перечисленных изолятов варьировала от 4 до 16мкг/мл, МПК имипенема - от 2 до 16 мкг/мл (таб. 9).99Всего у 51 карба-НЧ изолята P. aeruginosa было обнаружено 30различных структурных вариантов oprD-гена. Это свидетельствует о высокомразнообразии адаптационных изменений гена, детерминирующего один изважнейших механизмов формирования нечувствительности к карбапенемам.Логично предположить, что разные изменения по-разному влияют на фенотипрезистентности. Считается, что функциональная значимость структурныхизмененийгена«аминокислотнойзависитотлестницы»,ихместоположения.обеспечивающейВформированиинаправленноевсторонупериплазматического пространства движение субтрата по каналу OprD,участвуют14аминокислотныхостатков(таб.11)[38].Обрывпоследовательности гена в результате мутации, затрагивающей триплетынуклеотидов, соответствующих перечисленным аминокислотам, приводит кповреждениям OprD-порина с полным нарушением его функции [204].В нашем исследовании было обнаружено 24 варианта мутаций гена,которые затрагивали синтез «аминокислотной лестницы» (таб.
11): ISPsme1;ISPa26; nt 131,132ΔCA; ISPa195; nt 308Ant 309; nt 375,376CC→AG; nt 400ΔG; nt492Gnt 493; nt 584-nt 620Δ37 п. н.; nt 602-nt 612Δ11 п. н.; nt 619,620ΔCG; nt629G→T; nt 646Gnt 647; ISPa1328; ISPst2; nt 711Gnt 712; nt 786ΔA; nt 962C→T;nt 1092G→A; nt 1094C→T; nt 1274C→T; nt 1275Cnt 1276; nt1321G→A;nt1377ΔT.
Однако, корреляции между длиной синтезированной полипептиднойцепи OprD и МПК меропенема и имипенема обнаружено не было (длямеропенема и имипенема p > 0,05). Отсутствие корреляции можно объяснитьдвумя причинами. Не исключено, что проницаемость OprD для карбапенемовосуществляется по принципу «все или ничего». Иными словами, дистальныйобрыв полипептидной цепи порина блокирует его функцию в такой же степени,как и проксимальный.100Таблица 11Влияние мутации в гене oprD на синтез порина OprDСхематическая длина полипептидной цепи OprD в зависимостиМутация²ISPsme1<30ISPa26<30nt 131,132ΔCA<30ISPa19540nt 308Ant 30975nt375,376CC→AG100nt 400ΔG108nt492Gnt 493139nt584-nt620Δ37 п.н.169nt602-nt612Δ11 п.н.175nt619,620ΔCG181nt629G→T184nt646Gnt 647190ISPa1328201ISPst2208nt711Gnt 712212nt786ΔA237nt962C→T295nt1092G→A339nt1094C→T340nt1274C→T399nt1275Cnt 1276400nt1321G→A415nt1377ΔT43441039138937530730530430229729613012939Позиция аминокислоты¹30от уровня мутации в oprD-гене (количество аминокислот)Примечание: ¹ - перечислены позиции аминокислот, формирующих «аминокислотнуюлестницу»; ² - перечислены мутации, ведущие к обрыву синтеза OprD101Вторая причина отсутствия корреляции кроется в неоднородности выборки:подавляющее большинство штаммов с мутациями, ведущими к обрыву синтезаOprD(36/44,82%),обладалиразнымисочетаниямимеханизмовнечувствительности.
Информация о несогласованности между уровнем МПКмеропенема и имипенема и генетической структурой порина OprD говорит онеобходимостикомплекснойоценкимеханизмовформированиянечувствительности к карбапенемам. В литературе имеются многочисленныепредупреждения о некорректности анализа резистентности только за счетпориновой проницаемости без учета альтернативных механизмов [169]. Болееподробно анализ сложности многообразных сочетаний различных механизмоврезистентности и ее влияние на фенотип резистентности изложен в Главе 6.Показатели МПК меропенема у изолятов с oprD-инактивацией вкачестве единственного механизма резистентности варьируют от 4 до 16 мкг/мл(Ме = 8 (6; 12)), имипенема – от 2 до 16 мкг/мл (Me = 16 (16; 16).
Даже такоесерьезное повреждение генетической структуры как встраивание IS-элемента недает повышения МПК меропенема более 16 мкг/мл.Относительно низкие МПК при OprD-зависимой нечувствительностимогут говорить о наличии альтернативных путей поступления карбапенемов впериплазматическое пространство. Установлено, что меропенем проникает впериплазматическое пространство P. aeruginosa через два дополнительныхпорина – OpdP и OpdD [60, 216]. Можно предположить, что именно наличиедополнительных поринов для меропенема обуславливает более низкие МПКмеропенема по сравненению МПК имипенема в случае, когда порин-заисимыймеханизм является единственным механизмом резистентности к карбапенемам.Не исключается способность карбапенемов при очень высоких концентрацияхпроникать через наружную мембрану, используя неспецифический транспорт[251].Наши выводы об относительно низких уровнях МПК карбапенемов приизбирательной недостаточности OprD согласуются с литературными данными.102Установлено, что пониженный уровень экспрессии oprD-гена увеличиваетМПК имипенема лишь до величин от 4 до 8 мкг/мл [102].Что касается снижения уровня экспрессии у карба-НЧ изолятов, то онрегистрировался только в комплексе с другими механизмами резистентности –вместе с гиперактивностью эффлюкс-систем (у двух штаммов), в комплексе сгиперактивностью эффлюкс-систем и гиперпродукцией цефалоспориназ (у двухштаммов), в сочетании с гиперактивностью эффлюкс-систем и продукциейкарбапенемаз (у одного штамма).
Хотя его индивидуальный вклад вформирование резистентности оценить непросто, можно предположить, чтоснижение экспрессии oprD является важной составной частью формированиянечувствительности к карбапенемам при участии других механизмов, включаягиперактивностьэффлюкс-системигиперпродукциюцефалоспориназ(подробнее см. Главу 6).В целом, мутации, ведущие к обрыву синтеза OprD были обнаруженынами у 86% от всех карба-НЧ изолятов P.
aeruginosa, что соответствует даннымзарубежных авторов – от 30 до 90% [200, 204, 241]. Самым важнымрезультатом, полученным при исследовании структуры oprD, было открытиеновых IS-элементов у синегнойной палочки. Впервые в oprD-гене P. aeruginosaбыли найдены вставочные элементы ISPsme1 и ISPst2, до этого носителемISPsme1 считалась Pseudomonas mendocina, а носителем ISPst2 - Pseudomonasstutzeri [42, 221]. Данное наблюдение свидетельствует о возможностимежвидового транспорта вставочных последовательностей по крайней меревнутри рода Pseudomonas.Еще более значимым было обнаружение нового, ранее не описанного ISэлемента.Оннеимеетгомологиисизвестнымивставочнымипоследовательностями.
Нужно отметить, что существующие базы данных МГЭрегулярно пополняются записями о вновь обнаруженных IS-элементах в генахпоринов P. aeruginosa [241,81]. Открытие вставочного элемента ISPa195103свидетельствует о получении новых знаний в области возникновения ираспространения антибиотикорезистентности.Высокая частота встречаемости IS-элементов в генах oprD (у 25%клинических карба-НЧ изолятов P. aeruginosa) вызывает опасения. ISэлементы, как и все виды МГЭ, способны переноситься горизонтально впределахродственныхтаксонов.Следовательно,онимогутактивноперемещаться между госпитальными штаммами, обеспечивая распространениеoprD-зависимой нечувствительности к карбапенемам.
Можно предположить,что вставочные последовательности, повреждающие oprD, являются маркерамиэпидемиологическойзначимостиoprD-зависимойкарбапенемнечувствительности.Анализ полученных в настоящем разделе результатов позволяет сделатьнесколько выводов. Во-первых, нарушение генетической структуры и/илиснижение экспрессии гена порина OprD может приводить к возникновениюустойчивости P. aeruginosa к карбапенемам. 86% карба-НЧ изолятов имеютмутации, ведущие к обрыву синтеза порина OprD. У карба-НЧ изолятов безмутаций, ведущих к обрыву синтеза ОprD, наблюдается пониженный уровеньэкспрессии гена порина. Во-вторых, мутации, ведущие к обрыву синтеза поринаOprD, отличаются большим разнообразием и представлены преждевременнымистоп-кодонами, сдвигами рамки считывания в результате делеции или инсерциинуклеотидов, IS-элементами. Один из вариантов мутаций - нарушениепоследовательностиoprD-генаIS-элементом-особеннозначимиз-заспособности IS-элементов к горизонтальному переносу, а, следовательно, распространению oprD-зависимой нечувствительности к карбапенемам средигоспитальных штаммов.
В настоящем исследовании выявлено, что IS-зависимоеповреждение гена oprD является достаточно распространенным среди карба-НЧизолятов P. aeruginosa и обнаруживается у 25% из них. Важным открытием,сделанным в процессе исследования OprD-поринов, стало обнаружение нетипичных для синегнойной палочки IS-элементов, два из которых (ISPsme1 и104ISPst2) были описаны ранее у других видов рода Pseudomonas, а один тип(ISPa195) был неизвестен ранее. В-третьих, у большинства карба-НЧ изолятовP. aeruginosa оценка вклада OprD-зависимого механизма в общий уровеньрезистентности представляется затруднительной из-за того, что у 84% штаммовсoprD-инактивациейнечувствительности.былиПривыявленыотсутствиимножественныедополнительныхмеханизмымеханизмовустойчивости к карбапенемам OprD-зависимый механизм не приводит кповышению МПК карбапенемов более, чем до 4 – 16 мкг/мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
