Диссертация (1140384), страница 13
Текст из файла (страница 13)
aeruginosa.Примером этого является МС-оценка карбапенемаз у K. pneumoniae в работе А.Johansson et al.: все штаммы, продуцирующие карбапенемазы KPC, VIM иNDM, выявляются с помощью МАЛДИ-ВП МС. Однако, данный подход непозволяет достоверно определять продуцентов карбапенемаз среди штаммов P.aeruginosa: лишь у 6 из 11 VIM-продуцирующих изолятов были полученыположительные результаты [116]. Для повышения достоверности результатовнеобходим правильный подбор условий анализа: антибиотик-индикатор и егоконцентрация, время инкубации, матрица для МАЛДИ-ВП МС.Для подтверждения эффективности метода МАЛДИ-ВП МС при оценкекарбапенемазной активности у P. aeruginosa мы синтезировали подход,объединив методику Hrabak J.
et al. (2011) и статистическую обработкурезультатов Monteferrante C.G. et al. (2016) [106, 159]. В первой из этих работбыло установлено, что оптимальным антибиотиком-индикатором зависимого откарбапенемаз гидролиза для P. aeruginosa является меропенем, а оптимальнойматрицей - DHB. Выбор матрицы связан с тем, что целевые пики нативногомеропенема и продуктов его гидролиза скрываются шумами, создаваемымисигналамистандартнойматрицы для масс-спектрометрии-α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Матрица DHB не создает шумов, критичномаскирующих целевые пики. Однако, при данных условиях возникают случаиложноположительных и ложноотрицательных результатов. Следовательно, учетналичия/отсутствия сигналов нативного антибиотика и продуктов его гидролизане позволяет правильно оценить карбапенемазную активность тестируемыхштаммов и требуется дополнительная статистическая обработка сигналов.Такая обработка была предложена Monteferrante C.G., et al.
(2016) для оценкибета-лактамазнойактивностиэнтеробактерий[159].Проведенныеэксперименты показали полное соответствие результатов, полученных припомощи МАЛДИ-ВП МС и посредством традиционных методов. Это84доказывает перспективность использования масс-спектрометрии для оценкипродукции карбапенемаз клиническими штаммами P. aeruginosa.Анализ полученных в настоящем разделе результатов позволяет сделатьследующие выводы: 1) в формировании устойчивости P. aeruginosa ккарбапенемам важнейшая роль принадлежит металло-бета-лактамазам группыVIM, присутствие которых определяет высокие уровни МПК карбапанемов; 2)МАЛДИ-ВП МС является перспективным методом в практике клиническоймикробиологии для выявления изолятов P.
aeruginosa, продуцирующихкарбапенемазы; 3) формирование устойчивости к карбапенемам можетпроисходитьприучастиицефалоспориназ,гиперпродукциякоторыхдетектируется по интенсивности гидролиза нитроцефина; 4) инактивациякарбапенемов при помощи бета-лактамаз – МБЛ и цефалоспориназ – в 96%случаевсочетаетсяуP.aeruginosaсальтернативнымимеханизмамиформирования карбапенемрезистентности, включая нарушение пориновойпроницаемости и/или гиперактивностью эффлюкс-помп; 5) для полногопониманиямеханизмовнечувствительностисинегнойнойпалочкиккарбапенемам, необходимо комплексное исследование, приоритет которогодолжен быть нацелен на выявление карбапенем-гидролизующей активностибета-лактамаз P. aeruginosa.85Глава 4. Роль порина OprD в формировании нечувствительностиPseudomonas aeruginosa к антибиотикам группы карбапенемов4.1.
Введение к главеОдин из важнейших механизмов резистентности бактерий реализуется засчет нарушения транспорта антибиотика до своей мишени [14]. Длявоздействия на синегнойную палочку карбапенемы должны попасть впериплазматическое пространство, то есть проникнуть через наружнуюмембрану. Как уже говорилось, карбапенемы используют для этого естественносуществующие в мембране протеиновые каналы, которые называют поринами(см. «Обзор литературы»).Поданнымзарубежныхисследователей,от30до90%карбапенемрезистентных штаммов P.
aeruginosa имеют значимые поврежденияструктуры oprD-гена и/или отличаются снижением его экспрессии [200, 204,241]. О нарушениях oprD среди штаммов P. aeruginosa, циркулирующих нароссийской территории, информации нет.Настоящая глава посвящена анализу роли генов oprD в формированиинечувствительности клинических изолятов P. aeruginosa к карбапенемам.4.2. Материалы и методы, использованные для оценки роли порина OprDв формировании нечувствительности Pseudomonas aeruginosa к карбапенемамГенетическую структуру поринов обычно оценивают с помощьюсеквенированияпоследовательностейгеновисследуемыхштаммовипсоледующего сравнения полученных сиквенсов с последовательностью генаконтрольного штамма [179, 241]. На основе секвенирования гена oprDпроизводятпостроениеповрежденныхучастков3D-модели[169].поринаДанныесуказаниемметодылокализациипозволяютвыявлять86полиморфизмы и структурные изменения OprD, но не дают представления о егофункциональной полноценности.О функционировании порина можно судить по уровню экспрессии oprDгена[188].ФенотипическифункциюпоринаOprDоцениваютпопроникновению внутрь клетки специфических для OprD субстратов, например,аргинина [125].
Кинетика роста нормальных и OprD–дефектных штамов P.aeruginosa на среде, содержащей L-аргинин в качестве единственногоисточника углерода, указывает на отставание в росте штаммов с поврежденнымпорином OprD. Метод позволяет выявить сниженную функциональнуюактивность порина или ее полное отсутствие.В настоящем исследовании дизайн оценки генов oprD включал два этапа.На первом этапе у изолятов P.
aeruginosa определяли генетические нарушенияпутем секвенирования гена oprD и фланкирующих его областей с последующимсравнением полученных нуклеотидных последовательностей с oprD-геноммузейного штамма P. aeruginosa ATCC 27853. На втором этапе исследовалитолько изоляты, у которых на первом этапе не были обнаружены мутации,ведущие к обрыву синтеза OprD.
У них определяли уровень экспрессии oprDгена.Прианализерезультатовпроводилисопоставлениеструктурныхнарушений гена oprD и нарушений его экспрессии с уровнями МПКмеропенема и имипенема, а также с наличием альтернативных механизмоврезистентности.Объектом исследования были 60 штаммов P. aeruginosa. Штаммыотбирали из коллекции лаборатории микробиологии ФГАУ «НМИЦ здоровьядетей» в соответствии с критериями, описанными выше (см. главу «Материалыи методы исследования»). В качестве референсного изолята использовалиштамм из Американской коллекции типовых клеточных культур P.
aeruginosaАТСС 27853. Процедуры выявления альтернативных (бета-лактамазных иэффлюкс-зависимых) механизмов резистентности описаны в Главах 3 и 5,соответственно.87Для всех изолятов проводили секвенирование гена оprD и фланкирующихего областей, включая регион промотора. Методики получения ампликонов исеквенирования оprD описаны в главе «Материалы и методы исследования».Размеры ампликонов контролировали методом электрофореза в агарозном гелепо методике, изложенной в главе «Материалы и методы исследования». Длясеквенирования вставочных элементов, которые были обнаружены в гене oprD,использовали праймеры, последовательности которых указаны в таб.
9. Ихпоследовательности отбирали с помощью программ Oligo 7 (Molecular BiologyInsights) и Vector NTI Advance (Thermo Fisher Scientific, США). ИдентификациюIS-элементов проводили на основе базы данных «IS-finder» [212].Объем реакционной смеси составлял 20 мкл, включая 10 мкл реагентаiTaq™ Universal Probes Supermix (Bio-Rad, США), 0,5 мкМ каждого праймера, 5нг исследуемой ДНК. Условия амплификации: преинкубация при 95°C втечение 5 мин, 37 циклов трехшаговой амплификации (95°C - 30 с, 60°C - 30 с,72°C - 1 мин 15 с).Ампликоны очищали с помощью набора реагентов «Shrimp AlkalinePhosphatase» и Exonuclease I (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии спротоколомфирмы-изготовителя.СеквенированиепометодуСэнгерапроводили на секвенаторе 3500xL (Applied Biosystems, США) с помощьюнабора реагентов BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo FisherScientific, США) по протоколу фирмы-изготовителя.
IS-элементы ISPsme1секвенировали с помощью праймеров IS 81_1 F и IS 81_2 F, ISPa1328 – спомощью праймеров IS 678 F, IS 678_1 R и IS 678_2 R, ISPa26 – с помощьюпраймеров IS 66_1F и IS 66_2F, ISPst2 – с помощью праймеров IS 701_1R, IS701_2R, IS 701_1F, IS 701_2F, IS 701_3R, IS 701_4R, ISPa195 – с помощьюпраймеров IS 195_1 F и IS 195_2 F (таб. 9).88Таблица 9Праймеры для секвенирования IS-элементовНазваниеПоследовательностьIS 81_1 F5’ – TAATCGCGTATCGATAACCGA – 3’IS 81_2 F5’ – AGCCCGCGAGCGTCTAGGTGATT – 3’IS 195_1 F5’ – AAGTCATCAATGACGTTGAGCAG – 3’IS 195_2 F5’ – TCATGCATAAAGTCCATTGACCAA – 3’IS 678 F5’ – TCGATCTCGAAGCGGGCCACTTCA– 3’IS 678_1 R5’ - CCAATCGGCAGGTAGTCGTCATCC– 3’IS 678_2 R5’ - TTGGTGGTGTAGATCACCTTTCGG– 3’IS 66_1F5’ - TGTGCACAAGCCCGGACTCATCGT– 3’IS 66_2F5’ - TGAGCTTTGGCACCGAAGTAATA– 3’IS 701_1R5’ - AGAAGCGCTCCTTGTGCTCGTA– 3’IS 701_2R5’ - ATGGTGGCTATCCACTCGTCCA– 3’IS 701_1F5’ - TTGAATGTCATCTCAACTCCAA– 3’IS 701_2F5’ - TCTCAACTCCAAGACGCTCTA– 3’IS 701_3R5’ - GTGGATGGGCAGATCACGATA– 3’IS 701_4R5’ - TTGCAGGCCCGGCAGGTGTAT– 3’СравнениепоследовательностьюполученныхгенаoprDпоследовательностейчувствительногоoprDреференс-штаммасP.aeruginosa ATCC 27853 осуществляли с помощью программы Vector NTIAdvance (Thermo Fisher Scientific, США).У изолятов без мутаций, ведущих к обрыву синтеза OprD, определялиуровень экспрессии данного гена.
Методика выделения РНК, а такжетехнология определения количества РНК и расчет показателя экспрессииописаны в главе «Материалы и методы исследования». Оценку уровняэкспрессии проводили следующим образом. Для выборки, состоящей из89чувствительных изолятов, были определены медиана (Me) и процентили (0,25;0,75) значений показателя экспрессии. Значения показателя экспрессии,которые были меньше нижнего процентиля, считали пониженными.
Значенияпоказателя экспрессии, равные или превышающие 0,25-процентиль, считалинормальными.Статистическуюибиоинформационнуюобработкуполученныхрезультатов проводили при помощи программных пакетов IBM SPSS Statistics20.0 и Vector NTI Advance (Thermo Fisher Scientific, США).4.3. Результаты и обсуждениеПодробныеколичественныехарактеристикиустойчивостиккарбапенемам у исследованных изолятов P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
