Диссертация (1140384), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Примеры результатов выявления МБЛ у изолятов P. aeruginosa спомощью МБЛ-Е-тестаПримечание. А - P. aeruginosa 29-528, МБЛ-положительный штамм, МПК имипенема> 256 мкг/мл, МПК имипенема в присутствии ЭДТА - 4 мкг/мл (показано стрелкой),кратность уменьшения МПК в присутствии ЭДТА — 64; Б - P. aeruginosa 46-2598,МБЛ-отрицательный штамм, МПК имипенема 8 мкг/мл (стрелка 1), МПК имипенемав присутствии ЭДТА – 4 мкг/мл (стрелка 2).По результатам выявления карбапенемаз с помощью МАЛДИ-ВП МСкарбапенемазнуюактивность(гидролиз-положительныедемонстрировалиштаммы),29%нечувствительных(15/51)кштаммовкарбапенемам.Процент гидролиза меропенема при тестировании данных штаммов составлялот 7,6 до 59,3%, Ме = 13,6 (11,2; 38,8).72512МПК имипенема, мкг/млМПК меропенема, мкг/мл512128328МБЛ «-»МБЛ «+»1283282МБЛ «-»МБЛ «+»Рисунок 7. Значения МПК меропенема и имипенема у МБЛ-положительных иМБЛ-отрицательных изолятов P.
aeruginosaПримечание. МБЛ «+» - МБЛ-положительные изоляты; МБЛ «-» - МБЛотрицательные изоляты. Кругами отмечены показатели МПК, не входящие диапазонсредних значений.Примермасс-спектровгидролиз-положительныхигидролиз-отрицательных штаммов показан на рис.
8. Отсутствие карбапенемазнойактивности демонстрировали 71% (36/51) штаммов, нечувствительных ккарбапенемам. Процент гидролиза при их тестировании составлял от 0 до 4%.Ни один из контрольных карба-Ч изолятов не проявлял карбапенемазнойактивности: процент гидролиза — от 0 до 4,2% (таб. 8).73Рисунок 8. Пример спектров гидролиз-положительных и гидролиз-отрицательных штаммов после инкубации смеропенемомПримечание. Вверху спектр гидролиз-положительного штамма P. aeruginosa 58-3816, внизу – гидролиз-отрицательногомузейного штамма P. aeruginosa ATCC 27853 после инкубации с меропенемом. ПГ – пики продуктов гидролиза меропенема(m/z = 358, 380); НА – пики нативного меропенема (m/z = 384, 406, 428); I – интенсивность пиков (1х10³).Таблица 8Продукция МБЛ и гиперпродукция цефалоспориназ клинических изолятов P.
aeruginosaМПКМПКМБЛ-EНомер штамма меропенема, имипенема,тестмкг/млмкг/млПроцентгидролизамеропенемаVIMАктивностьцефалоспориназДругие механизмы резистентностиКарба-НЧ штаммы1. МБЛ-положительные штаммыРеференсштамм VIM-2¹+31,6+0,14256512+42,46+Не показано²oprD-инактивация, гиперэффлюкс29-572256256+54,91+Не показаноoprD-инактивация39-381256512+27,65+Не показаноoprD-инактивация, гиперэффлюкс39-648256512+59,32+Не показаноoprD-инактивация, гиперэффлюкс46-36512512+9,29+Не показаноoprD-инактивация46-73264128+11,5+Не показаноoprD-инактивация, гиперэффлюкс48-1223256512+9,12+Не показаноoprD-инактивация, гиперэффлюкс49-11849-315512512512512++12,911,27++Не показаноНе показаноoprD-инактивацияoprD-инактивация49-442128512+16,06+Не показаноoprD-инактивация, гиперэффлюкс57-21358-34858-3816256512512256512512+++11,214,2754,78+++Не показаноНе показаноНе показаноoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивация7429-528Продолжение таблицы 8МПКМПКМБЛ-EНомер штамма меропенема, имипенема,тестмкг/млмкг/млПроцентгидролизамеропенемаVIMАктивностьцефалоспориназДругие механизмы резистентности7,58+Не показаноoprD-инактивация, гиперэффлюкс68-158256256+46-2068128128+36-1071256128-36-1747512128-3,75-0,1oprD-инактивация, гиперэффлюкс36-17581632-0-0,02oprD-инактивация, гиперэффлюкс36-2170328-0-0oprD-инактивация, гиперэффлюкс36-318536-98946-15102561681283216-002,33-0,090,130,01oprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивация46-161184-0-0,01oprD-инактивация, гиперэффлюкс46-1619256128-0-0,19oprD-инактивация46-19761632-0-0oprD-инактивация, гиперэффлюкс46-20321632-0-0,01oprD-инактивация, гиперэффлюкс46-259848-0-0,01oprD-инактивация, гиперэффлюкс21,22+Не показано2.
МБЛ-отрицательные штаммы4,010,09Не обнаруженоoprD-инактивация75Продолжение таблицы 8МПКМПКМБЛНомер штамма меропенема, имипенемE-тестмкг/мла, мкг/млПроцентгидролизамеропенемаVIMАктивностьцефалоспориназДругие механизмы резистентности3216-0-0,07oprD-инактивация, гиперэффлюкс46-310946-312251282562-00-0,090,09oprD-инактивацияГиперэффлюкс46-3126256128-0-0,14oprD-инактивация, гиперэффлюкс46-3463816-0-0,02oprD-инактивация, гиперэффлюкс46-60488-0-0,1oprD-инактивация, гиперэффлюкс46-6651616-1,8-0,02oprD-инактивация46-814432-0-0,09oprD-инактивация, гиперэффлюкс46-81848-123148-129948-133088481616162-0000-0,010,020,010,01oprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивацияoprD-инактивация48-1558416-0-0oprD-инактивация, гиперэффлюкс48-1626168-3,43-0oprD-инактивация, гиперэффлюкс48-204948-237425682568-1,760-0,090,02oprD-инактивацияoprD-инактивация7646-306Продолжение таблицы 8МПКМПКМБЛ-EНомер штамма меропенема, имипенема,тестмкг/млмкг/млПроцентгидролизамеропенемаVIMАктивностьцефалоспориназДругие механизмы резистентности3232-1,04-0oprD-инактивация, гиперэффлюкс49-45312864-0-0,14oprD-инактивация, гиперэффлюкс49-4673216-0-0,01oprD-инактивация, гиперэффлюкс49-55056-88312886416-3,311,5-0,150,01oprD-инактивацияoprD-инактивация52-1621616-2,05-0,04oprD-инактивация, гиперэффлюкс52-348241-0-0,11oprD-инактивация, гиперэффлюкс49-6216416-3,31-0,14oprD-инактивация, гиперэффлюксКарба-Ч штаммы (контроль)Референсштамм E.
coliATCC 25922³120242-173944-118944-90646-202700,510,520,5120,750,50,5-02,072,34,190-00000Не обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаруженоНе обнаружено7749-436Продолжение таблицы 8МПКМПКМБЛ-EНомер штамма меропенема, имипенема,тестмкг/млмкг/млПроцентгидролизамеропенемаVIMАктивностьцефалоспориназДругие механизмы резистентности7846-24911200Не обнаружено48-7570,250,2500Не обнаружено66-891100,01Не обнаруженоATCC 278531100Не обнаруженоПримечания:¹ - в качестве положительного контроля для определения карбапенемаз с помощью МБЛ-Е-теста, ПЦР в реальном времени иМАЛДИ-ВП МС и выявления гиперпродукции цефалоспориназ использовали референсный штамм P. aeruginosa VIM-2;² - активность цефалоспориназ определяли только у МБЛ-отрицательных штаммов в связи с тем, что все известные МБЛобладают сильной цефалоспориназной активностью;³ - в качестве негативного бактериального контроля для определения активности цефалоспориназ использовали референс штамм E.
coli ATCC 2592279Результаты, полученные с помощью МАЛДИ-ВП МС, генетическогоанализа (выявление генов карбапенемаз) и МБЛ-Е-теста характеризовалисьвысокой степенью согласованности (рис. 9). Статистический показательсогласованности (каппа Коэна) результатов, полученных тремя методами,подтверждал их максимальную согласованность (ĸ = 1, p = 0,001).Рисунок 9. Карбапенемазная активность изолятов P. aeruginosa: результаты,полученные тремя методами (МБЛ-E-тест, определение наличия геновкарбапенемаз, гидролиз меропенема по результатам МАЛДИ-ВП МС)Примечание.
Белыми кругами показаны VIM-отрицательные штаммы, серымиромбами – VIM-положительные штаммы.Примеррезультатоввыявленияцефалоспориназнойактивностиизолятов P. aeruginosa с помощью нитроцефина представлен на рис. 10.у80Рисунок 10. Пример результатов выявления цефалоспориназной активности уизолятов P. aeruginosa с помощью нитроцефинаПримечание. Лунки A1, A2, A3 – отрицательный бактериальный контроль Escherichiacoli ATCC 25922, активность цефалоспориназ равна 0 ед.
ОП; лунки A4, A5, A6 –положительныйбактериальныйконтрольP.aeruginosaVIM-2,активностьцефалоспориназ равна 0,14 ед. ОП; лунки H10, H11, H12 - негативный контроль(бумажные диски без антибиотика); штаммы с гиперпродукцией цефалоспориназ(активность цефалоспориназ > 0,08 ед. ОП): P. aeruginosa 36-1071 (лунки B7, B8, B9),P. aeruginosa 36-3185 (лунки C1, C2, C3), P. aeruginosa 46-3109 (лунки C7, C8, C9), P.aeruginosa 46-1619 (лунки D1, D2, D3), P. aeruginosa 46-604 (лунки D4, D5, D6), P.aeruginosa 46-814 (лунки E1, E2, E3), P. aeruginosa 48-2049 (лунки E10, E11, E12), P.aeruginosa 46-3122 (лунки F1, F2, F3), P.
aeruginosa 49-550 (лунки F10, F11, F12), P.aeruginosa 36-1747 (лунки G1, G2, G3); в остальных триплетах лунок - штаммы безгиперпродукции цефалоспориназ.Результаты выявления цефалоспориназной активности исследованныхштаммов представлены в таб. 8. Показатели гидролиза нитроцефина у всехМБЛ-негативных изолятов P. aeruginosa (n = 45) колебались в диапазоне от 0 до810,19 ед. ОП, Ме = 0,02 (0,00; 0,08). В качестве порога («cut off») для оценкигиперпродукции АmpC было установлено значение верхнего процентиля,равное 0,08 ед.
ОП.Показатели гидролиза нитроцефина карба-НЧ МБЛ-негативных изолятов(n = 36) регистрировались в диапазоне от 0 до 0,19 ед. ОП, Ме = 0,03 (0,01; 0,1).Всего среди МБЛ-негативных изолятов было выявлено 44,6% (15/36) изолятов сгиперпродукцией цефалоспориназ. Гидролиз нитроцефина у референсногоVIM-2-позитивного изолята P. aeruginosa составлял 0,14 ед. ОП. Негативный поцефалоспориназам референс-штамм E. coli ATCC 25922 демонстрировалнулевую активность гидролиза нитроцефина. Значения МПК меропенема уштаммов с гиперпродукцией цефалоспориназ регистрировались в диапазоне от4 до 512 мкг/мл (Ме = 128 (16; 256)), имипенема – от 1 до 256 мкг/мл (Ме = 64(32; 128)).
На рис. 11 показано распределение изолятов P. aeruginosa взависимости от МПК меропенема и активности гидролиза нитроцефина.Корреляционная связь между уровнем МПК изолята и гиперпродукциейцефалоспориназ была статистически значимой: коэффициент корреляцииКендела для меропенема был равен 0,78 (p = 0,001), для имипенема – 0,81(p =0,001).Среди генов карбапенемаз у изученных штаммов P. aeruginosa былиобнаружены лишь гены металло-бета-лактамаз группы VIM. Их несли почти30% карба-НЧ изолятов.
Эти же изоляты демонстрировали фенотипическиепризнакиналичияМБЛ.Изоляты,необладающиеblaVIM-генами,фенотипически не проявляли МБЛ-активность. Следовательно, опосредованнаяканоническимикарбапенемазамиустойчивостьккарбапенемамсредиисследованных штаммов была связана исключительно с МБЛ VIM-типа.Следует признать, что VIM-карбапенемазы являются доминирующими средикарбапенемрезистентных клинических изолятов, циркулирующих в России.Доля МБЛ-положительных изолятов среди всех нозокомиальных изолятов,82нечувствительных к карбапенемам, в 2002-2010 годах составила 28,7%, средикоторых носительство blaVIM-2-генов достигало 99,6% [75].Рисунок 11.
Активность цефалоспориназ и значения МПК меропенема карба-Ч икарба-НЧ МБЛ-отрицательных изолятов P. aeruginosaПримечание. Белыми кругами показаны карба-Ч изоляты; белыми треугольниками –карба-НЧ изоляты без гиперпродукции цефалоспориназ; серыми треугольниками –карба-НЧизолятысгиперпродукциейцефалоспориназ;пунктирнойлиниейобозначено пороговое значение для оценки гиперпродукции цефалоспориназ.Данные о наличии карбапенемаз, полученные традиционными методами,были подтверждены путем обнаружения продуктов гидролиза меропенема припомощи МАЛДИ-ВП МС. Хотя масс-спектрометрия и признана надежныминструментом для детекции бета-лактамаз у отдельных групп бактерий, ееэффективность для определения карбапенемаз у P. aeruginosa, до настоящего83времени оставалась под сомнением. Некоторые методики, успешные дляэнтеробактерий, оказываются неподходящими для тестирования P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
