Диссертация (1140384), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Бета-лактамазы, относящиеся к функциональному классуцефалоспориназ, тоже способны к слабому гидролизу карбапенов, хотя иреализуюткарбапенемрезистентностьтольковсинергизмесдругимимеханизмами резистентности (см. «Обзор литературы»).Выявление бета-лактамаз, гидролизирующих карбапенемы, являетсякрайне важным для клинической медицины, так как знание механизмарезистентностидаетвозможностьдляназначенияадекватнойантибиотикотерапии. В частности, информация о продукции бета-лактамазпозволяет прогнозировать эффективность применения препаратов, защищенныхингибиторами бета-лактамаз.Одним из перспективных методов оценки бета-лактамазной активностибактерий является масс-спектрометрия.
При помощи масс-спектрометриивозможно быстро определить наличие у тестируемого штамма карбапенемаз.Проведено большое число исследований по масс-спектрометрической детекциикарбапенемаз энтеробактерий, которые показали хорошо воспроизводимыерезультаты [122, 129, 207]. Более сложная ситуация складывается привыявлении карбапенемаз у P.
aeruginosa. Разные авторские коллективы66предлагают разные условия эксперимента, изменяя состав растворов, в которыхпроисходит гидролиз, время реакции и даже тип матрицы для МС [61, 105, 106,116]. Это говорит о необходимости оптимизации МС-технологии выявлениякарбапенемаз у P. aeruginosa, которая приведет к разработке чувствительного ихорошовоспроизводимогометода,характеризующегосявысокойспецифичностью и простотой выполнения.В настоящей главе проанализированы два практических подхода дляоценкибета-лактамазнойактивностиP.Первыйaeruginosa.подходпредставляет собой модифицированный протокол детекции карбапенемаз у P.aeruginosa с помощью масс-спектрометриии. Второй методический подходнаправлен на количественную оценку цефалоспориназной активности поинтенсивностигидролизацефалоспориназнойнитроцефина.активностиНапомним,являетсячтоактуальнымисследованиеприоценкекарбапенемрезистентности у синегнойной палочки в связи c тем, что P.aeruginosa вырабатывает цефалоспориназу AmpC, гиперпродукция которой вкомплексе с активацией эффлюкса и снижением пориновой проницаемостиможет обеспечивать устойчивость к карбапенемам.3.2.
Материалы и методы, использованныедля оценки роли бета-лактамаз в формировании нечувствительностиPseudomonas aeruginosa к карбапенемамДля решения задач, поставленных в данном разделе исследования, былииспользованы следующие способы: 1) фенотипическое определение наличияМБЛ у штаммов P. aeruginosa; 2) определение наличия генов карбапенемаз; 3)модифицированный метод масс-спектрометрической детекции карбапенемаз уклинических изолятов и музейных штаммов P.
aeruginosa; 4) определениецефалоспориназной активности у изолятов P. aeruginosa, не продуцирующихМБЛ, при помощи теста с нитроцефином.67МПК меропенема и имипенема исследуемых изолятов определяли припомощи метода серийных разведений (см. главу «Материалы и методыисследования»). Дополнительно для оценки уровня резистентности былииспользованы два критерия: критерий МПК 50 меропенема подразумевалзначение МПК для 50% исследованных штаммов, МПК90 меропенема — для90% исследованных штаммов.Для фенотипического определения наличия карбапенемаз молекулярногокласса B использовали МБЛ-Е-тесты (BioMerieux, Франция) в соответствии срекомендациями фирмы-изготовителя (подробнее методика изложена в главе«Материалы и методы исследования»). Наличие МБЛ регистрировалось вслучае 8-кратного уменьшения МПК имипенема в присутствии ЭДТА.Тестирование изолятов на наличие генов карбапенемаз VIM, IMP и NDMпроводили при помощи коммерческих наборов для ПЦР в реальном времени«MDR MBL-FL» (АмплиСенс) согласно протоколам фирмы-производителя(ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора).
Процедуры определенияальтернативныхмеханизмоврезистентности(oprD-инактивацияигиперэффлюкс) описаны в главах 4 и 5, соответственно.Для определения наличия карбапенемаз с помощью МАЛДИ-ВП МСиспользовали суточную культуру P. aeruginosa, выращенную на агаре МюллераХинтона (BioRad, США). Материал, собранный бактериологической петлей (1мкл) из одной колонии (диаметр 1,5-3,0 мм) добавляли к 0,2 мл базовогораствора меропенема (1 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере (pH 7,2),содержащем ZnCl2 (0,01 мг/мл), и тщательно вортексировали. Процедуруповторяли с тремя колониями данного изолята. Раствор с тестируемымштаммом и антибиотиком инкубировали при 37°С в течение 3 ч припокачивании (240 движений в минуту), после чего останавливали реакциюдобавлением 0,2 мл ацетонитрила.
Раствор центрифугировали, надосадочнуюжидкость помещали на мишень. В качестве матрицы использовали 2,5дигидроксибензойную кислоту (DHB, от англ. «2,5-dihydroxybenzoic acid»),68растворенную в концентрации 10 мг/мл в 50%-ном растворе метанола. Спектрыснимали на масс-спектрометре Biotyper Microflex (Bruker, Германия) вдиапазоне 100 - 1000 Да, спектры формировались по результатам не менее 240лазерных импульсов. Все эксперименты повторяли трижды.
В качественегативного контроля использовали референс-штамм P. aeruginosa АТСС 27853,не продуцирующий карбапенемаз. Масс-спектры обрабатывали с помощьюпрограммного обеспечения flexAnalysis 3.3 (Bruker, Германия). Учитывализначения интесивности пиков нативного антибиотика - m/z = 384, 406, 428 - ипиков продуктов его гидролиза - m/z = 358, 380. Процент гидролизарассчитывали по формуле:ПГ =ППГ(ППГ + ПНА)х 100 – ПГНК, гдеПГ - процент гидролиза, ППГ - сумма интенсивностей пиков продуктовгидролиза, ПНА - сумма интенсивностей пиков нативного антибиотика, ПГНК процент гидролиза в негативном контроле.
Наличие карбапенемазы утестируемого штамма подтверждалось в случае регистрации гидролиза более5%.В качестве положительного контроля выявления карбапенемаз с помощьюМБЛ-Е-теста, ПЦР и МАЛДИ-ВП МС использовали референсный штамм P.aeruginosa VIM-2 из коллекции НИИ антимикробной химиотерапии (НИИАХ)ФГБОУВО«Смоленскийгосударственныймедицинскийуниверситет»Минздрава РФ, продуцирующий МБЛ VIM-2.Для статистической обработки результатов использовали программныйпакет IBM SPSS Statistics 20.0. Для сравнения эффективности трех методовоценкикарбапенемазнойактивности-МБЛ-Е-тест,выявлениегеновкарбапенемаз, МАЛДИ-ВП МС - рассчитывали стандартный статистическийпоказатель, определяющий степень парной согласованности результатов, - мерусогласованности ĸ (каппа Коэна). Каппа Коэна имеет максимум 1 при полнойсогласованности, и равна 0 в том случае, если согласованность между оценками69(тестами) наблюдается не чаще, чем можно было бы ожидать при случайномсовпадении.Значенияĸ>0,75считаютсядостаточнойстепеньюсогласованности [85].Активность цефалоспориназ у МБЛ-отрицательных изолятов оценивалипо степени гидролиза нитроцефина согласно методике, описанной Tam V.H.
etal. в собственной модификации [222]. Суточную культуру P. aeruginosa,выращенную на агаре Мюллера-Хинтона, вносили в фосфатно-солевой буфер(рН = 7,2), содержащий ZnCl2 (0,01 мг/мл). Концентрацию бактерийстандартизовали по оптической плотности, доводя до 1,5 единиц по шкалеМакФарланда. В пробирку с 0,45 мл полученной суспензии помещали диск снитроцефином (0,5 мг, Becton Dickinson, США). Инкубировали 30 мин при 37оСв при непрерывном покачивании (250 движений в минуту). После инкубацииреакцию гидролиза останавливали путем добавления к реакционной смесиэквивалентного объема ацетонитрила. Пробирку центрифугировали при 10000gв течение 3 мин.
Из надосадочной жидкости отбирали 0,2 мл и переносили влунки 96-луночного планшета Nuclon Surface (лунки с плоским дном,производство - Thermo Fisher Scientific, США, кат. номер 167008). В качествеположительного бактериального контроля использовали референсный штамм P.aeruginosa VIM-2. В качестве негативного бактериального контроля применялиреференс-штамм Escherichia coli ATCC 25922, не продуцирующий беталактамазы. В качестве негативного контроля активности нитроцефинаиспользовали бумажные диски без антибиотика. Количественное определениепродуктовгидролизанитроцефина,образовавшихсяподвлияниемцефалоспориназ и карбапенемаз, проводили на плашечном спектрометреInfinityM200(Tecan,Австрия).Оптическуюплотностьсупернатантовреакционной взвеси измеряли при длине волны 485 нм. Из полученныхзначений оптической плотности для каждого штамма вычитали показательнегативного контроля (бактерии с бумажными дисками без антибиотика).Результаты выражали в единицах оптической плотности (ед.
ОП). В качестве70порогового значения гидролиза использовали 0,75-процентиль выборки,содержащей значения гидролиза нитроцефина у всех изолятов P. aeruginosa, необладающих МБЛ. Изоляты со значениями гидролиза нитроцефина вышеверхнегопроцентилярассматриваликакизолятысгиперпродукциейприродных цефалоспориназ.3.3.
Результаты и обсуждениеУровень МПК меропенема карба-НЧ изолятов варьировал от 4 до 512мкг/мл, МПК имипенема – от 2 до 512 мкг/мл. МПК50 меропенема для всехкарба-НЧ изолятов составила 32 мкг/мл, МПК 90 меропенема — 512 мкг/мл.МБЛ-Е-тест (рис. 6) выявил наличие металло-бета-лактамаз у 15 из 51(29%) карба-НЧ штаммов (МБЛ-положительные штаммы). Из них 20% (3/15)демонстрировали уменьшение МПК имипенема в присутствии ЭДТА в 128 раз,13% (2/15) – в 85 раз, 6% (1/15) —в 64 раза, 20% (3/15) —в 43 раза, 35% (5/15) –в 32 раза, 6% (1/15) - в 24 раза. Ни у одного из карба-Ч изолятов не обнаруженометалло-бета-лактамаз.У всех МБЛ-положительных штаммов (15/51) был выявлен генкарбапенемазы типа VIM. Ни у одного из МБЛ-отрицательных штаммов (36/51)и ни у одного из карба-Ч изолятов не обнаружено генов карбапенемаз.МПК50 и МПК90 меропенема для МБЛ-негативных штаммов составляли 16мкг/мл и 128 мкг/мл, соответственно.
МПК50 и МПК90 меропенема для МБЛпозитивныхштаммовпревышалисоответствующиепоказателиМБЛ-негативных изолятов, составляя 256 мкг/мл и 512 мкг/мл. Средние показателиМПК имипенема (Ме = 512 (256; 512)) и меропенема (Ме = 256 (256; 512)) уМБЛ-позитивных изолятов также значительно превышали соответствующиезначения МБЛ-негативных изолятов (для меропенема Me = 16 (8; 128).,71для имипенема Me = 16 (16; 64) (рис. 7). Корреляционная связь между уровнемМПК изолята и наличием у него МБЛ была статистически значима(коэффициент корреляции Кендела для меропенема равен 0,86 (p = 0,001), дляимипенема – 0,90 (p = 0,001)).12АБРисунок 6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
