Диссертация (1140384), страница 10
Текст из файла (страница 10)
aeruginosa 27853 и Escherichia coli 25922.2.2 Бактериологические методыОпределение МПК меропенема и имипенема для изолятов P. aeruginosaпроводили в соответствии с частью 1 стандарта ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010«Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробныхагентовпротивинфекционныебыстрорастущихболезни»[4].Дляаэробныхбактерий,приготовлениявызывающихосновныхрастворовантибиотиков использовали фосфатный буфер (Thermo Fisher Scientific, США).Концентрации меропенема и имипенема (Sigma-Aldrich, США) в основныхрастворах составляли 40960 мкг/мл. Путем десятикратного разбавленияосновных растворов с последующими двукратными разведениями получалиосновные растворы с концентрациями в диапазоне от 1 до 4096 мкг/мл. Длядальнейшего анализа использовали основные растворы с концентрациями40960 мкг/мл, 4096 мкг/мл, 512 мкг/мл, 64 мкг/мл, 8 мкг/мл и 1 мкг/мл. Дляполучения рабочих растворов с концентрациями в диапазоне от 0,25 мкг/мл до4096 мкг/мл выбранные основные растворы разбавляли бульоном МюллераХинтона (Bio-Rad, США) в два, четыре, восемь или десять раз по схеме,представленной в таб.
5 [4]. Рабочие растворы антибиотиков вносили в лункипланшетов для микроразведений (планшеты с круглым дном) по 50 мкл. Дляприготовления инокулюма тестируемых изолятов использовали суточнуюкультуру, выращенную на неселективной плотной питательной среде. Культурувносили в бульон Мюллера-Хинтона так, чтобы конечная концентрациямикроорганизмов составляла 5х105 КОЕ/мл (концентрацию получали путем1000-кратного разведения суспензии микроорганизмов с мутностью 0,5 единицпо шкале МакФарланда).59Таблица 5Схема приготовления рабочих растворов антибиотиков для определениячувствительности P. aeruginosa к меропенему и имипенемуКонцентрация антибиотика восновном растворе, мкг/млКратность разведенияосновного раствораКонцентрация антибиотика врабочем растворе, мкг/мл40960104096409622048409641024409685125122256512412851286464232644166488824842881120,5140,25Планшетысмикроразведениямиантибиотковинокулировалиисследуемыми штаммами (по 50 мкл) и инкубировали при 37°C.
Учетрезультатовпроводиличерез18часов.Минимальнаяконцентрацияантибиотика, при которой отсутствовали видимые признаки бактериальногороста, соответствовала значению МПК (рис. 5).ДляпостановкиМБЛ-Е-тестаиспользовалисуточныекультурыисследуемых штаммов P. aeruginosa, выращенные на агаре Мюллера-Хинтона(Bio-Rad, США). Суспензию бактериальных клеток с мутностью 0,5 единиц пошкале МакФарланда наносили на плотную питательную среду (агар МюллераХинтона (Bio-Rad, США)) ватным тампоном.
После нанесения суспензии60полоску МБЛ-Е-теста (BioMerieux, Франция) помещали на поверхностьпитательной среды. Среды инкубировали 24 часа при 37ºС. Результатучитывали по кратности уменьшения значения МПК имипенема на шкале«имипенем+ЭДТА» по сравнению со значением МПК на шкале «имипенем».Тест считали положительным при кратности уменьшения МПК равной илибольшей 8.Рисунок 5. Пример определения МПК меропенема методом серийных разведенийдля штаммов P. aeruginosaПримечание. Лунки планшета 1 – 11 – разведения концентраций меропенема вдиапазоне от 2 до 2048 мкг/мл, лунка 1 – максимальная концентрация (2048 мкг/мл),лунка 11 – минимальная концентрация (2 мкг/мл), лунка 12 – контроль ростатестируемого штамма (без антибиотика); исследуемые штаммы расположены в рядахпланшета A – H: ряд A - P.
aeruginosa 46-818, МПК 8 мкг/мл, ряд B - P. aeruginosa 481299, МПК 4 мкг/мл, ряд C - P. aeruginosa 49-442, МПК 128 мкг/мл, ряд D - P.aeruginosa 58-3816, МПК 512 мкг/мл, ряд E - P. aeruginosa 56-883, МПК 8 мкг/мл, рядF - P. aeruginosa 46-1619, МПК 256 мкг/мл, ряд G - P. aeruginosa 36-1747, МПК 512мкг/мл, ряд H - P. aeruginosa 36-1071, МПК 512 мкг/мл.612.3 Молекулярно-генетические методыДля выделения ДНК использовали суточные культуры исследуемыхштаммов P.
aeruginosa, выращенные на агаре Мюллера-Хинтона (Bio-Rad).Бактериальную ДНК выделяли с помощью набора «DNeasy Blood & Tissue Kit»(Qiagen, Германия) по протоколу фирмы-производителя. Полученные образцыхранили при -20ºС.Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для получения ампликонов генаoprD проводили с помощью амплификатора LightCycler96 (Roche, США).Объем реакционной смеси составлял 20 мкл, включая 10 мкл реагента iTaq™Universal Probes Supermix (Bio-Rad, США), по 0,5 мкМ прямого и обратногопраймеров, 5 нг исследуемой ДНК. Условия амплификации: преинкубация при95°C в течение 5 минут, 37 циклов трехшаговой амплификации (95°C - 30 с,60°C - 30 с, 72°C - 1 мин 15 с).
Праймеры для амплификации и секвенированиягена oprD синтезировали в соответствии с известными рекомендациями [169,198]. Последовательности праймеров приведены в таб. 6. В качествеположительного контроля использовали ДНК штамма P. aeruginosa ATCC27853.Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 2%-ном агарозном геле. Дляприготовления геля использовали агарозу (Thermo Fisher Scientific, США) вбуфере «TBE» (Bio-Rad, США), в который добавляли этидиум бромид (Bio-Rad,США) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
Электрофорез проводили принапряжении 130 В в течение 30 минут в камере для горизонтальногоэлектрофореза (Bio-Rad, США). Для детекции ампликонов использовалисистему гель-документации (Bio-Rad, США). Для определения размераампликонов использовали маркеры длин ДНК «MassRuler™ DNA Ladder Mix»(Thermo Fisher Scientific, США).62Таблица 6Праймеры для амплификации и секвенирования гена oprD [169, 198]НазваниеПоследовательностьOprD_FlankF5’ - CGGCTGAGGGGAAAGTCGCC – 3’OprD_FlankR5’ - TACGCGGTCATTCTCGGGCG – 3’OprD.F5’ - GGAACCTCAACTATCGCCAAG – 3’OprD.R5’ - GTTGCCTGTCGGTCGATTAC – 3’OprD2.F5’ - ACTTCACCGAGGGCAAGG – 3’OprD2.R5’ - CAGAGTTGGCGAGGAAAATC – 3’Для подготовки исследуемых ампликонов к реакции секвенированияосуществляли очистку с помощью набора реагентов «Shrimp AlkalinePhosphatase» и Exonuclease I (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии спротоколом фирмы-изготовителя.
Условия реакции получения ампликонов длясеквенирования: преинкубация при 96°C в течение 5 мин, 30 цикловтрехшаговой амплификации (96°C - 15 с, 55°C - 10 с, 60°C - 4 мин).Секвенирование по методу Сэнгера проводили на секвенаторе 3500xL (AppliedBiosystems, США) с помощью набора реагентов «BigDye™ Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit» (Thermo Fisher Scientific, США).Результаты секвенирования обрабатывали с помощью программы VectorNTI Advance (https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/life-science/cloning/vectornti-software.html).
Подбор праймеров для секвенирования осуществляли спомощью программ Oligo 7 (http://www.oligo.net/) и Vector NTI Advance.Идентификацию IS-элементов проводили на основе базы данных «IS-finder»[212].Экспрессию гена oprD оценивали в соответствии с международнымирекомендациями по проведению экспериментов для анализа экспрессии генов[50]. РНК исследуемых изолятов выделяли с помощью набора реагентов RNeasyPlus Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу фирмы-изготовителя.63Очистку полученных образцов РНК от остаточной ДНК и получениекомплементарной ДНК (кДНК) осуществляли с помощью набора QuantiTectReverse Transcription Kit (Qiagen, Германия). Реакцию обратной транскрипции(реакцию получения кДНК) проводили в течение 30 минут при 37°С.Концентрацию кДНК измеряли на приборе Qubit 4 Fluorometer (Thermo FisherScientific, США), каждый образец стандартизовали так, чтобы концентрациякДНК составляла 2 нг/мкл.
Образцы кДНК хранили при тепературе -20°С.Реакцию ПЦР в реальном времени проводили с помощью амплификатораLightCycler96. Данные о флуоресценции обрабатывали с помощью программыLightCycler® 96 SW 1.1 (Roche, США). Объем реакционной смеси составлял 20мкл, включая 10 мкл реагента iTaq™ Universal Probes Supermix (Bio-Rad,США), 1 мкМ каждого праймера, 0,5 мкМ FAM-меченого зонда, 2 нг кДНК. Вкачестве отрицательного контроля использовали реакционную смесь без кДНК.Последовательности праймеров и зондов для гена oprD и внутреннегостандарта экспрессии (ген фактора транскрипции rpoD) указаны в таб.
7 [188].Условия амплификации: преинкубация при 95°C в течение 5 минут, 34 циклатрехшаговой амплификации (94°C - 15 с, 61,5°C - 15 с, 72°C - 20 с).Специфичностьпродуктовамплификацииподтверждалиспомощьюэлектрофореза в агарозном геле. В качестве контрольного штамма для расчетапоказателя экспрессии использовали штамм P. aeruginosa ATCC 27853.Показатели экспрессии гена oprD рассчитывали по формуле:R = (EoprD)ΔCt (control – test) / (ErpoD) ΔCt (control – test) ,где R – показатель экспресси гена oprD, Ct test – пороговый цикл тестируемогоштамма, Ct control – пороговый цикл контрольного штамма, EoprD эффективность ПЦР с кДНК oprD, ErpoD – эффективность ПЦР с кДНК rpoD. Вовсех экспериментах эффективность ПЦР была равна 2, что соответствовалоудвоению ДНК за каждый цикл амплификации [50].
Для каждого штаммаэксперимент повторяли дважды, усредненные значения показателей экспрессиииспользовали для дальнейшего анализа.64Таблица 7Праймеры для определения экспрессии генов oprD и rpoD [188]НазваниеПоследовательностьПраймеры для определения экспрессии гена oprDoprD_For5-CTACGGCTACGGCGAGGAT-3oprD_Rev5-GACCGGACTGGACCACGTACT-3oprD_Probe[DFAM] CACCACGAAACCAACCTCGAAGCC [DTAM]Праймеры для определения экспрессии гена rpoDRpoD_For5-GGGCTGTCTCGAATACGTTGA-3RpoD_Rev5-ACCTGCCGGAGGATATTTCC-3RpoD_Probe[DFAM]TGCGGATGATGTCTTCCACCTGTTCC [DTAM]Тестирование изолятов на наличие генов карбапенемаз VIM, IMP и NDMпроводили при помощи коммерческих наборов для ПЦР в реальном времени«MDR MBL-FL» (АмплиСенс) согласно протоколам фирмы-производителя(ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора).2.4 Статистические методыСтатистическую обработку результатов проводили с помощью программSPSS 20.0 (SPSS Statistics) и Excel (Microsoft), используя общепринятыестатистические критерии (медиана Ме, 0,25- и 0,75-процентили, коэффициентыкорреляции Кендела и Спирмена, мера согласованности каппа Коэна ĸ,критерий Манна-Уитни U, уровень значимости р) [3].65Глава 3.
Роль бета-лактамаз в формировании нечувствительностиPseudomonas aeruginosa к антибиотикам группы карбапенемов3.1. Введение к главеОдним из основных механизмов формирования резистентности P.aeruginosaкбета-лактамнымантибиотикамявляетсяферментативнаяинактивация с помощью бета-лактамаз. Как уже говорилось, из-за своейклиническойзначимостибета-лактамазы,активногидролизирующиеантибиотики группы карбапенемов, были выделены в особую функциональнуюгруппу и получили название карбапенемаз [189]. Считается, что карбапенемазывносят самый существенный вклад в развитие устойчивости P. aeruginosa ккарбапенемам [197].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
