Автореферат (1140383), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Роль эффлюкс-систем в формировании нечувствительности Pseudomonas aeruginosaк антибиотикам группы карбапенемовГиперактивность эффлюкса была выявлена у 28 из 51 (55%) карба-НЧ изолятов. Кратностьуменьшения КОР, равную 4, демонстрировали 16 из 28 изолятов (57%) с гиперактивностьюэффлюкса, у 6/28 (21%) изолятов данный показатель был равен 16, у 3 (3/28, 11%) изолятов –кратность уменьшения КОР была равна 8.
Три остальных штамма имели кратность уменьшенияКОР, равную 32, 64 и 128. У 23/51 (45%) карба-НЧ изолятов и у всех карба-Ч штаммов не быловыявлено гиперактивности эффлюкса. Значения МПК меропенема у штаммов с гиперактивностьюэффлюкса регистрировались в диапазоне от 4 до 512 мкг/мл (Ме = 32 (8; 128)), имипенема – от 1 до512 мкг/мл (Ме = 32 (16; 128)). Корреляции между наличием гиперактивности эффлюкса изначениями МПК меропенема и имипенема выявлено не было (для меропенема и имипенема p >0,05). Гиперактивность эффлюкса в качестве единственного механизма нечувствительности не былавыявлена ни у одного штамма.
Она сочеталась с oprD-инактивацией (мутации, ведущие к обрывусинтеза OprD или снижение экспрессии oprD) у 13/28 (46%) изолятов, с oprD-инактивацией ипродукцией карбапенемаз - у 7/28 (25%), с oprD-инактивацией и гиперпродукцией цефалоспориназ –у 7/28 (25%). У одного штамма гиперактивность эффлюкса сочеталась только с гиперпродукциейцефалоспориназ (МПК меропенема была равна 8 мкг/мл, МПК имипенема – 2 мкг/мл). Сочетаниегиперэффлюкса с другими механизмами затрудняет избирательную оценку вклада этого механизма вобщий уровень карбапенемрезистентности.
Тем не менее, эффлюкс-насосы являются важным20инструментом реализации устойчивости к бета-лактамам. Об этом говорят не только литературныеданные (Chalhoub H. et al., 2016; Quale J. et al, 2006). Косвенным доказательством роли эффлюкспомп, полученным в настоящем исследовании, является отсутствие усиления эффлюкс-процессов учувствительных к карбапенемам штаммов.5. Комплексная оценка механизмов резистентности Pseudomonas aeruginosa к карбапенемамУ карба-НЧ изолятов (n = 51) P. aeruginosa выявлено 8 вариантов сочетаний механизмовнечувствительности. Сочетание «карбапенемаза + oprD-инактивация» выявлено у 14% (7/51)изолятов, сочетание «карбапенемаза + гиперэффлюкс + oprD-инактивация» – у 14% (7/51), сочетание«гиперпродукция цефалоспориназ + oprD-инактивация» – у 14% (7/51), сочетание «гиперпродукцияцефалоспориназ + гиперэффлюкс + oprD-инактивация» – у 14% (7/51), сочетание «гиперэффлюкс +oprD-инактивация» – у 25% (13/51), oprD-инактивация – у 15% (8/51) изолятов (рис.
4). Былобнаружен один изолят с наличием только карбапенемазы и один изолят с сочетанием«гиперпродукция цефалоспориназ + гиперэффлюкс», поэтому для этих механизмов отсутствовалавозможность статистической обработки данных.Рисунок 4. Варианты сочетаний механизмов устойчивости к карбапенемам у карба-НЧштаммов P. aeruginosaПри сравнении МПК карбапенемов (меропенема и имипенема) между группой штаммов ссочетанием «карбапенемаза + oprD-инактивация» и группой штаммов с сочетанием «гиперпродукцияцефалоспориназ + oprD-инактивация» были выявлены статистически значимые различия (p = 0,038 иp = 0,002 для меропенема и имипенема, соответственно).
Значения МПК в группе штаммов с первымвариантом сочетания были выше, чем значения в группе со вторым сочетанием. Между МПКкарбапенемов у группы штаммов с сочетанием механизмов «гиперпродукция цефалоспориназ +21oprD-инактивация» и группы штаммов с сочетанием «гиперпродукция цефалоспориназ +гиперэффлюкс + oprD- инактивация» не было выявлено статистически значимых различий (p = 0,165и p = 0,053 для меропенема и имипенема, соответственно). При сравнении МПК карбапенемов междугруппой штаммов с oprD-инактивацией и группой штаммов с сочетанием «гиперпродукцияцефалоспориназ + oprD-инактивация» были выявлены статистически значимые различия (p = 0,001для меропенема и имипенема).
Значения МПК в группе штаммов с сочетанием «гиперпродукцияцефалоспориназ + oprD-инактивация» были выше, чем значения в группе с oprDинактивацией.РазличиямеждузначениямиМПКкарбапенемовуштаммов,продуцирующихкарбапенемазы, и штаммов без карбапенемаз («oprD-инактивация», «гиперэффлюкс + oprDинактивация», «гиперпродукция цефалоспориназ + гиперэффлюкс + oprD-инактивация») былистатистически значимы (см. раздел 2). Между значениями МПК карбапенемов у групп штаммов ссочетаниями механизмов, включающих продукцию карбапенемаз («карбапенемаза + гиперэффлюкс+ oprD-инактивация», «карбапенемаза + oprD-инактивация»), не было выявлено статистическизначимых различий (p > 0,05).Проведенный статистический анализ, направленный на сравнение влияния отдельныхмеханизмов резистентности P. aeruginosa, а также их сочетаний, на уровень МПК карбапенемов,позволяет сделать несколько выводов: (1) механизмы резистентности, присутствующие уклинических изолятов синегнойной палочки, неодинаково влияют на уровень МПК карбапенемов;(2) продукция синегнойной палочкой карбапенемаз вызывала самое сильное повышение МПКмеропенема и имипенема, независимо от наличия других механизмов резистентности; (3) вторым позначимости для повышения уровня МПК являются сочетания механизмов резистентности,включающие гиперпродукцию цефалоспориназ; (4) самым часто встречающимся сочетаниеммеханизмов резистентности к карбапенемам является наличие гиперактивности эффлюкс-систем иинактивация oprD.ВЫВОДЫ1.
В осуществлении ферментативной инактивации карбапенемов (меропенема и имипенема) укарбапенемнечувствительных изолятов P. aeruginosa принимает участие два типа бета-лактамаз:цефалоспориназы в сочетании с другими механизмами устойчивости (гиперэффлюкс и/или oprDинактивация) и металло-бета-лактамазы группы VIM. Наличие инактивирующих карбапенемы беталактамаз (металло-бета-лактамазы VIM-группы и гиперпродукция цефалоспориназ) ассоциируется уклинических изолятов P. aeruginosa с формированием наиболее высоких значений МПК меропенемаи имипенема.222.Фактпродукциикарбапенемаз(металло-бета-лактамазгруппыVIM)укарбапенемнечувствительных изолятов P.
aeruginosa быстро и достоверно выявляется с помощьюматрично-активированнойлазернойдесорбционно-ионизационнойвремяпролетноймасс-спектрометрии.3. Инактивация порина OprD (мутации в гене oprD, ведущие к обрыву синтеза порина OprD, атакжеснижениеэкспрессииoprD)являетсянаиболеераспространенныммеханизмомнечувствительности к карбапенемам у клинических изолятов P.
aeruginosa. Мутации в гене oprD унечувствительных к карбапенемам изолятов P. aeruginosa отличаются высокой степеньюразнообразия и представлены преждевременными стоп-кодонами, сдвигами рамки считывания ивставкой мобильных генетических элементов (IS).4. У штаммов P. aeruginosa с инактивацией порина ОprD, не сочетающейся с продукциейкарбапенемаз и гиперпродукцией цефалоспориназ, регистрируется более низкий уровеньрезистентности к карбапенемам, чем у штаммов, продуцирующих металло-бета-лактамазы группыVIM или гиперпродуцирующих цефалоспориназы.5. Гиперактивность RND-эффлюкс-систем является часто встречающимся свойствомкарбапенемнечувствительных изолятов и не регистрируется у карбапенемчувствительных штаммовP. aeruginosa.6. Различия между уровнями устойчивости к карбапенемам среди клинических изолятов P.aeruginosa с разными сочетаниями механизмов возникают лишь благодаря продукции металло-беталактамаз группы VIM или гиперпродукции цефалоспориназ, которые статистически значимоповышают уровни резистентности к меропенему и имипенему.ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ1.
Для оптимизации антибактериальной терапии синегнойной инфекции, вызваннойкарбапенемнечувствительными штаммами, необходимо проводить расшифровку механизмовустойчивости изолята-возбудителя P. aeruginosa к карбапенемам при помощи фенотипических,молекулярно-генетических и масс-спектрометрических методов.2. Для ускоренного выявления карбапенемазных механизмов устойчивости у клиническихизолятов P. aeruginosa предлагается использовать вариант матрично-активированной лазернойдесорбционно-ионизационной времяпролетной масс-спектрометрии, описанный в настоящемдиссертационном исследовании.3.
Для детального определения бета-лактамазных механизмов резистентности P. aeruginosa ккарбапенемам целесообразно применение упрощенного (с использованием МБЛ-Е-теста и теста снитроцефином) или развернутого (с использованием МАЛДИ-ВП МС, детекции генов карбапенемаз23итестаснитроцефином)лабораторно-диагностическихалгоритмов,предложенныхвдиссертационном исследовании.4. Для повышения эффективности эпидемиологических исследований, направленных наизучениециркуляциикарбапенемрезистентныхштаммовP.вaeruginosa,качествеэпидемиологических маркеров следует использовать вставочные элементы, отвечающие заформирование OprD-зависимой устойчивости к карбапенемам и выявляемые с помощьюмолекулярно-генетических методов.ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ1. Перспективным направлением дальнейших исследований по теме диссертационной работыявляется разработка фенотипических способов определения порин- и эффлюкс-зависимыхмеханизмов резистентности P.
aeruginosa к карбапенемам.2. Планируется разработка способов оценки участия порин- и эффлюкс-зависимыхмеханизмов в формировании карбапенемрезистентности у клинических изолятов P. aeruginosa припомощи матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной времяпролетной массспектрометрии.3. Планируется адаптация способа масс-спектрометрической детекции карбапенемаз у P.aeruginosa, направленная на возможность его использования для обнаружения карбапенемазнепосредственно в клиническом материале (кровь, ликвор) от пациента.4.
Планируется проведение молекулярно-генетического исследования генов opdD и opdP укарбапенемнечувствительных изолятов P. aeruginosa; указанные гены кодируют порины наружноймембраны ОpdD и ОpdP, являющиеся потенциальными транспортерами карбапенемов внутрьбактериальной клетки, а следовательно, их инактивация может рассматриваться в качествемеханизма карбапенемрезистентности.ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1.Чеботарь,И.В.ИспользованиеMALDI-TOF-технологиидляидентификациивозбудителей септических состояний в педиатрической практике / И.В. Чеботарь, О.А.
Пономаренко,А.В. Лазарева, О.В. Карасева, А.Л. Горелик, Ю.А. Бочарова, Р.Ф. Тепаев // Современныетехнологии в медицине. – 2015. – Т. 7, № 2. – С. 68-74.2.Лазарева, А.В. Распространенность металло-бета-лактамаз и эффлюкс-механизмов укарбапенемрезистентных госпитальных штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных в г. Москве в2012-2015 годах / А.В. Лазарева, О.А. Крыжановская, Ю.А.
Бочарова, И.В. Чеботарь, Н.А. Маянский// Вестник Российской академии медицинских наук. – 2015. – Т.70, № 6. – С. 679–683.243.Бочарова, Ю.А. Возможности, проблемы и перспективы масс-спектрометрическихтехнологий в медицинской микробиологии (обзор литературы) / Ю.А. Бочарова, И.В. Чеботарь,Н.А. Маянский // Клиническая лабораторная диагностика. – 2016. – Т. 61, № 4. – С. 249-256.4.Бочарова, Ю.А.
Новый способ оценки активности порин-зависимых механизмоврезистентности к карбапенемам у Pseudomonas aeruginosa / Ю.А. Бочарова // Сборник материаловроссийско-китайской научно-практической конференции по медицинской микробиологии иклинической микологии «XIX Кашкинские чтения». - Санкт-Петербург, 2016. - С. 32.5.Чеботарь, И.В. Механизмы резистентности Pseudomonas aeruginosa к антибиотикам иих регуляция / И.В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
