Автореферат (1140383), страница 4
Текст из файла (страница 4)
ОП) для каждого штамма вычитали показатель негативногоконтроля. В качестве порогового значения гидролиза использовали 0,75-процентиль выборки,содержащей значения гидролиза нитроцефина у всех МБЛ-негативных изолятов P. aeruginosa.Изоляты со значениями гидролиза нитроцефина выше верхнего процентиля рассматриваликак изоляты с гиперпродукцией природных цефалоспориназ.Оценку активности эффлюкс-систем проводили с помощью ингибитора эффлюкс-помпкарбонил-цианид-3-хлорфенилгидразона(СССР,отангл.«сarbonylсyanide3-сhlorophenylhydrazone»).
Сравнивали концентрацию меропенема, при которой отсутствовалрост тестируемых изолятов (концентрация отсутствия роста - КОР), в опыте (среда сдобавлением CCCP) и контроле (среда без CCCP). Оценку активности эффлюкс-помппроводили согласно известным рекомендациям (Adabi M. et al., 2015). Считали, что штаммдемонстрирует значимую для формирования устойчивости активность эффлюкс-систем(гиперактивность эффлюкс-систем, гиперэффлюкс) в тех случаях, когда наблюдалосьуменьшение КОР в присутствии СССР в 4 и более раз по сравнению с контрольными пробамибез СССР.Статистическую обработку результатов проводили с помощью программных пакетов,обеспечивающих работу масс-спектрометрического и генетического оборудования, а такжепрограмм SPSS 20.0 (SPSS Statistics) и Excel (Microsoft), используя общепринятыестатистические критерии (медиана Ме, 0,25- и 0,75-процентили, коэффициенты корреляцииКендела и Спирмена, мера согласованности каппа Коэна ĸ, критерий Манна-Уитни U, уровеньзначимости р) (Герасимов А.Н., 2007).142.
Роль бета-лактамаз в формировании нечувствительностиPseudomonas aeruginosa к антибиотикам группы карбапенемовУровень МПК меропенема карба-НЧ изолятов варьировал от 4 до 512 мкг/мл, МПКимипенема – от 2 до 512 мкг/мл. Для всех карба-НЧ изолятов показатель МПК50 меропенемасоставлял 32 мкг/мл, МПК90меропенема — 512 мкг/мл. МБЛ-Е-тест выявил наличиеметалло-бета-лактамаз у 15 из 51 (29%) карба-НЧ штаммов (МБЛ-положительные штаммы).Ни у одного из карба-Ч изолятов не было обнаружено металло-бета-лактамаз. У всех МБЛположительных штаммов (15/51) был выявлен ген карбапенемазы типа VIM. Ни у одного изМБЛ-отрицательных штаммов (36/51) и ни у одного из карба-Ч изолятов не было обнаруженогенов карбапенемаз.
МПК 50 и МПК90 меропенема для МБЛ-негативных штаммов составляли16 мкг/мл и 128 мкг/мл соответственно. МПК 50 и МПК90 меропенема для МБЛ-позитивныхштаммов превышали соответствующие показатели МБЛ-негативных изолятов, составляя 256мкг/мл и 512 мкг/мл. Средние показатели МПК имипенема (Ме = 512 (256; 512)) и меропенема(Ме = 256 (256; 512)) у МБЛ-позитивных изолятов также значительно превышалисоответствующие значения МБЛ-негативных изолятов (для меропенема Me = 16 (8; 128), дляимипенема Me = 16 (16; 64)) (рис.
1). Корреляционная связь между уровнем МПК изолята иналичием у него МБЛ была статистически значима (коэффициент корреляции Кендела длямеропенема равен 0,86 (p = 0,001), для имипенема – 0,90 (p = 0,001)). По результатамвыявлениякарбапенемазспомощьюМАЛДИ-ВПМСкабапенемазнуюактивностьдемонстрировали 29% (15/51) нечувствительных к карбапенемам штаммов (гидролизположительные штаммы).512МПК имипенема, мкг/млМПК меропенема, мкг/мл512128328МБЛ «-»МБЛ «+»1283282МБЛ «-»МБЛ «+»Рисунок 1. Значения МПК меропенема и имипенема у МБЛ-положительных и МБЛотрицательных изолятов P.
aeruginosaПримечание. МБЛ «+» - МБЛ-положительные изоляты; МБЛ «-» - МБЛ-отрицательныеизоляты. Кругами отмечены показатели МПК, не входящие диапазон средних значений.15Процент гидролиза меропенема при тестировании данных штаммов составлял от 7,6 до59,3%, Ме = 13,6 (11,2; 38,8) (таб. 1).Отсутствие карбапенемазной активностидемонстрировали 71% (36/51) карба-НЧ штаммов: процент гидролиза составлял от 0 до 4%.Ни один из контрольных карба-Ч изолятов не проявлял карбапенемазной активности: процентгидролиза - от 0 до 4,2% (таб. 1).Таблица 1Продукция карбапенемаз и гиперпродукция цефалоспориназ клиническихизолятов P. aeruginosaХарактеристикаштаммовnМПКМПКГидролизмеропенема,имипенема, МБЛАктивностьVIM меропенема,мкг/мл,мкг/мл,Е-тестЦФ%Ме (0,25; 0,75) Ме (0,25; 0,75)Продукция КП(карба-НЧштаммы)15256 (256;512)512 (256; 512)++7,6 – 59,3Непоказано¹ГиперпродукцияЦФ (карба-НЧштаммы)15128 (16; 256)128 (32; 128)--0–40,09 – 0,198 (8; 16)16 (8; 16)--0 – 3,40 – 0,07≤2≤2--0 – 4,20 – 0,01Карба-НЧ штаммыбез КП21и гиперпродукцииЦФКарба-Ч штаммы9Примечание.
¹ - активность цефалоспориназ определяли только у МБЛ-отрицательныхштаммов в связи с тем, что все известные МБЛ обладают сильной цефалоспориназнойактивностью. КП – карбапенемаза, ЦФ – цефалоспориназы, n – количество штаммов.Результаты, полученные с помощью МАЛДИ-ВП МС, генетического анализа(выявление генов карбапенемаз) и МБЛ-Е-теста характеризовались высокой степеньюсогласованности, значение каппы Коэна ĸ = 1 (рис. 2).Показатели гидролиза нитроцефина у всех МБЛ-негативных изолятов P. aeruginosa (n =45) колебались в диапазоне от 0 до 0,19 ед.
ОП, Ме = 0,02 (0,00; 0,08). Таким образом, вкачестве порога для оценки гиперпродукции цефалоспориназ было установлено значениеверхнего процентиля, равное 0,08 ед. ОП. Всего среди карба-НЧ МБЛ-негативных изолятовбыло выявлено 44,6% (15/36) изолятов с гиперпродукцией цефалоспориназ. Все они обладалидополнительными механизмами резистентности. Значения МПК меропенема у штаммов сгиперпродукцией цефалоспориназ регистрировались в диапазоне 4 – 512 мкг/мл (Ме = 128(16; 256)), имипенема – 1 – 256 мкг/мл (Ме = 64 (32; 128)).16Кратность уменьшения МПКимипенемав присутствии ЭДТА,логарифмическая шкала1000100101110100Гидролиз меропенема, % (МАЛДИ-ВП МС),логарифмическая шкалаРисунок 2. Карбапенемазная активность изолятов P.
aeruginosa: результаты, полученныетремя методами (МБЛ-E-тест, определение наличия генов карбапенемаз, гидролизмеропенема по результатам МАЛДИ-ВП МС)Примечание. - VIM-отрицательные штаммы, – VIM-положительные штаммы.На рис. 3 показано распределение изолятов P. aeruginosa в зависимости от МПКмеропенема и активности гидролиза нитроцефина. Корреляционная связь между уровнемМПКизолятаигиперпродукциейцефалоспориназбыластатистическизначимой:коэффициент корреляции Кендела для меропенема был равен 0,78 (p = 0,001), для имипенема– 0,81(p = 0,001).Таким образом, значения МПК меропенема и имипенема у VIM/МБЛ-позитивныхштаммов находятся на самых высоких уровнях, это логично объясняется тем, чтокарбапенемазы VIM-типа обладают очень сильной гидролитической активностью вотношении карбапенемов, уступающей в количественном отношении лишь NDM-металлобета-лактамазам (Lassaux P.
et al, 2011). Наличие карбапенемаз у P. aeruginosa достоверновыявляется при помощи модифицированного протокола для МАЛДИ-ВП МС, предложенногов настоящем исследовании. Помимо продукции карбапенемаз бета-лактамазные механизмырезистентности включают гиперпродукцию природных цефалоспориназ, которые способныосуществлять медленный гидролиз карбапенемов (Riera E. et al., 2011). В настоящемисследовании показано, что в синергизме с другими механизмами (инактивация oprD игиперэффлюкс) гиперпродукция данных ферментов приводит к формированию высокихуровней резистентности. Это соответствует литературным данным (Quale J.
et al., 2006).МПК меропенема, мкг/мл(логарифмическая шкала)17Активность цефалоспориназ, ед. ОПРисунок 3. Активность цефалоспориназ и значения МПК меропенема карба-Ч и карбаНЧ МБЛ-отрицательных изолятов P. aeruginosaПримечание.– карба-Ч изоляты;– карба-НЧ изоляты без гиперпродукциицефалоспориназ;– карба-НЧ изоляты с гиперпродукцией цефалоспориназ; пунктирнойлинией обозначено пороговое значение для оценки гиперпродукции цефалоспориназ.3. Роль порина OprD в формировании нечувствительности Pseudomonas aeruginosa кантибиотикам группы карбапенемовВ результате секвенирования ампликонов гена oprD было обнаружено два типа поврежденийгенетической структуры. К первой группе (тип 1) были отнесены изоляты с заменами аминокислот вoprD, все изоляты, чувствительные к меропенему и имипенему, попали в первую группу. Ко второйгруппе (тип 2) – изоляты с мутациями, ведущими к обрыву синтеза OprD (преждевременным стопкодоном, сдвигом рамки считывания вследствие делеции или инсерции нуклеотидов, а такжеизоляты с IS-элементом в гене oprD) (таб.
2). Всего обнаружено 24 вида повреждений гена второготипа, в том числе 7 разновидностей стоп-кодонов, 5 разновидностей инсерций, 7 разновидностейделеций и 5 разновидностей IS-элементов. IS-элементы ISPa195, ISPsme1 и ISPst2 были обнаруженыу P. aeruginosa впервые.Уровень показателя экспрессии oprD у карба-Ч штаммов колебался от 0,6 до 1,3 (Ме = 1,0(0,8; 1,2)), поэтому в качестве нижней границы нормального уровня экспрессии гена было выбранозначение 0,8. В группе изолятов без мутаций, ведущих к обрыву синтеза OprD (изоляты первойгруппы – 16 штаммов), показатель экспрессии варьировал в диапазоне от 0 до 1,3 (Me = 0,9 (0,6; 1,2)).В целом, между показателями экспрессии у карба-Ч изолятов из первой группы и показателями18экспрессии у карба-НЧ изолятов из той же группы не было выявлено статистически значимыхразличий (р > 0,05).
Все изоляты с пониженным уровнем экспрессии oprD обладалидополнительными механизмами резистентности к карбапенемам.Таблица 2Типы нарушений, ведущих к oprD-инактивации у карба-НЧ изолятовP. aeruginosaКоличество изолятов (среди карба-НЧизолятов)Тип нарушенияМутации,ведущие кобрывусинтезаOprDПреждевременный стоп-кодонвследствие замены нуклеотидов16/51 (31%)Сдвиг рамки считываниявследствие делеции/инсерциинуклеотидов15/51 (30%)IS-элемент13/51 (25%)Всего44/51 (86%)Пониженный уровень экспрессии ¹5/7Всего49/51 (96%)Примечание. ¹ - оценка экспрессии oprD проводилась только у штаммов без мутаций ведущихк обрыву синтеза OprDМутации, ведущие к обрыву синтеза OprD, были найдены у 44/51 (86%) карба-НЧ изолятов.82% из них (36/44) обладали дополнительными механизмами нечувствительности к карбапенемам.Корреляции между уровнем мутации, ведущей к обрыву OprD, и МПК меропенема иимипенема обнаружено не было (для меропенема и имипенема p > 0,05). Лишь у 8исследованных штаммов oprD-инактивация (мутации, ведущие к обрыву синтеза OprD, илиснижение уровня экспрессии oprD) была единственным механизмом резистентности к карбапенемам(карбапенемазы,гиперэффлюксигиперпродукцияцефалоспориназотсутствовали).МПКмеропенема у перечисленных изолятов варьировала от 4 до 16 мкг/мл, МПК имипенема - от 2 до 16мкг/мл.
Невысокие значения МПК карбапенемов при нечувствительности, обусловленной тольконарушением проницаемости OprD, свидетельствуют о наличии дополнительных путей поступлениякарбапенемоввпериплазматическоепространство.Вчастности,транспортмеропенемаосуществляют два дополнительных порина – OpdP и OpdD (Chevalier S. et al., 2017; SoundararajanG. et al., 2017).Самым важным результатом, полученным при исследовании структуры oprD, было открытиеновых IS-элементов у синегнойной палочки (таб. 3).
Впервые в oprD-гене P. aeruginosa были найденывставочные элементы ISPsme1 и ISPst2, которые ранее были описаны у Pseudomonas mendocina иPseudomonas stutzeri, соответственно (Bolognese F. et al., 1999; Szuplewska M. et al., 2014).19Таблица 3IS-элементы, обнаруженные в гене oprD карба-НЧ изолятов P. aeruginosaНазвание IS-элементаКоличество штаммовISPsme14ISPa13286ISPa261ISPst21ISPa1951IS-элемент ISPa195, обнаруженный в ходе исследования, не имеет гомологии с известнымивставочными последовательностями. Новый IS-элемент зарегистрирован в базе данных GenBank,депонирован в базах BioProject (режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/436637) иIS-finder(режимдоступа:https://isfinder.biotoul.fr/scripts/ficheIS.php?name=ISPa195).Способность IS-элементов к горизонтальному переносу, а, следовательно, распространению oprDзависимой нечувствительности к карбапенемам среди госпитальных штаммов рода Pseudomonas,свидетельствует об эпидемиологической значимости этого механизма резистентности.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
