Автореферат (1140383), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Наличие металло-бета-лактамаз выявляли при помощиМБЛ-Е-теста (BioMerieux, Франция), наличие генов карбапенемаз и экспрессию гена oprDопределяли при помощи полимеразной цепной реакции в реальном времени. Продукциюцефалоспориназ оценивали при помощи спектрофотометрии, карбапенемазную активность –при помощи масс-спектрометрии. Мутации в гене oprD определяли при помощисеквенирования по методу Сэнгера.
Активность эффлюкс-систем оценивали при помощиингибитора эффлюксных систем - карбонил-цианид-3-хлорфенилгидразона. Статистическуюобработку данных проводили при помощи программы SPSS 20.0 (SPSS Statistics).Степень достоверности и апробация результатов исследованияО достоверности результатов работы свидетельствует использование современныхадекватных методов исследования, которые характеризуются высокой чувствительностью,специфичностью и объективностью, а также поддерживаются программным обеспечением,позволяющим проводить статистический анализ больших массивов данных.Вработеиспользовалисьмикробиологические,молекулярно-генетические,спектрофотометрические и масс-спектрометрические методы.
Все виды оборудования, накотором проводились исследования, проходили регулярную метрологическую поверку.Объем проведенных исследований позволил осуществить корректную статистическуюобработку полученных данных.10Диссертацияапробированана заседаниилабораторногоотделаФедеральногогосударственного автономного учреждения «Национальный медицинский исследовательскийцентр здоровья детей» Министерства здравоохранения Российской Федерации (протокол №5от 22.12.2017 г.).Материалы диссертации были представлены на 27-ом Европейском конгрессе поклинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (ECCMID - Вена, 2017), наНаучно-практическойконференциипомедицинскоймикробиологиииклиническоймикологии (XIX Кашкинские чтения - СанктПетербург, 2016), на Заседании секциимедицинской и фармацевтической микробиологии Московского отделения Всероссийскогонаучно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва,2017).Личный вклад автора в получение результатовЛичное участие соискателя в получении результатов, изложенных в диссертации,заключалось в проведении микробиологической части исследования (культуральный посев,идентификация и реиндентификация бактерий, определение минимальных подавляющихконцентраций меропенема и имипенема), оценке цефалоспориназной и карбапенемазнойактивности изолятов, определении активности эффлюкс-систем, проведении секвенированияи оценке экспрессии гена oprD у P.
aeruginosa в лаборатории микробиологии ФГАУ «НМИЦздоровья детей» Минздрава России. Выбор материала для исследования проводилсясовместно с зав. лабораторией микробиологии ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» к.м.н.Лазаревой А.В. Определение наличия металло-бета-лактамаз проводилось совместно с м.н.с.Пономаренко О.А., выявление генов карбапенемаз проводилось совместно с к.м.н.Крыжановской О.А.
(ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России). Секвенированиегенов oprD проводилось совместно с к.б.н. Савиновой Т.А. (ФГАУ «НМИЦ здоровья детей»Минздрава России). Биоинформатическая обработка экспериментальных результатов (массспектрометрии, генетических исследований) проводилась совместно с Маянским Н.А. (ФГАУ«НМИЦ здоровья детей» Минздрава России), Карасевой О.В. («НИИ НДХиТ» ДЗМ),Тепаевым Р.Ф. (ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России) и Гореликом А.Л.
(«НИИНДХиТ» ДЗМ).Внедрение результатов диссертации в практикуРезультаты исследований в качестве диагностических технологий внедрены впрактическую работу подразделений ФГАУ «НМИЦ здоровья детей» Минздрава России,«НИИ неотложной детской хирургии и травматологии» Департамента здравоохранениягорода Москвы, ГБУЗ «Городская клиническая больница № 15 им.
О.М. Филатова»11ДепартаментаздравоохранениягородаМосквы,ФГБНУ«Научно-исследовательскийинститут глазных болезней».Соответствие диссертации паспорту научной специальностиНаучные положения диссертации соответствуют формуле специальности 03.02.03 –«микробиология», области исследований «Морфология, физиология, биохимия и генетикамикроорганизмов».ПубликацииРезультаты проведенного диссертационного исследования в полном объеме изложеныв 7 научных работах, из которых: 5 работ (три оригинальных статьи и два обзора литературы)опубликованы в журналах из перечня рецензируемых научных изданий ВАК, 5 работ (триоригинальных статьи и два обзора литературы) - в журналах, реферируемых РИНЦ, 4 работы(три оригинальных статьи и обзор литературы) - в журналах, реферируемых базой данныхScopus, 1 оригинальная статья - в журнале, реферируемом базой данных Web of Science.Объем и структура диссертацииДиссертация изложена на 178 страницах машинописного текста и состоит из введения,основной части (обзора литературы, описания материалов и методов исследования и 4 глав,отражающих результаты собственных исследований), заключения, выводов, практическихрекомендаций, описания перспектив дальнейшей разработки темы, списка сокращений иусловных обозначений, списка литературы.
Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 22рисунками. Библиографический указатель включает 257 источников литературы, в том числе21 ссылка на отечественных авторов и 236 ссылок на зарубежных авторов.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ1. Материалы и методы исследованияОбъектами исследования являлись штаммы P. aeruginosa из рабочей коллекциилаборатории микробиологии ФГАУ "Национальный медицинский исследовательский центрздоровья детей" Минздрава России, собранной в течение 2012 — 2016 гг. Были выбраны всеизоляты, нечувствительные к меропенему и/или имипенему (карба-НЧ изоляты).
В качествекритериев нечувствительности использовали значения МПК, установленные Клиническимирекомендациями «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробнымпрепаратам» (2015 г.) и Европейским комитетом по определению чувствительностимикроорганизмов к антимикробным препаратам (European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing, EUCAST, 2018). Для основной части исследования был отобран 51карба-НЧ изолят.
Для контроля в анализе механизмов резистентности использованы 812карбапенемчувствительных (карба-Ч) штаммов, два штамма из коллекции American TypeCulture Collection (ATCC).Определение МПК меропенема и имипенема проводили с помощью метода серийныхразведений в соответствии с частью 1 стандарта ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010 «Референтныйметодлабораторногоисследованияактивностиантимикробныхагентовпротивбыстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни». Наличиеметалло-бета-лактамаз(МБЛ)определялиспомощьюМБЛ-Е-теста(BioMerieux)всоответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.Бактериальную ДНК выделяли с помощью набора «DNeasy Blood & Tissue Kit»(Qiagen) по протоколу фирмы-производителя. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) дляполучения ампликонов гена oprD проводили с помощью амплификатора LightCycler96(Roche).
Для электрофореза продуктов ПЦР использовали 2%-ный агарозный гель(напряжение 130 В, 30 минут). Секвенирование по методу Сэнгера проводили на секвенаторе3500xL (Applied Biosystems) с помощью набора реагентов «BigDye™ Terminator v3.1 CycleSequencing Kit» (Thermo Fisher Scientific). Биоинформатическую обработку результатовсеквенирования осуществляли с помощью программы Vector NTI Advance (Thermo FisherScientific). Идентификацию IS-элементов проводили на основе базы данных «IS-finder»(https://www-is.biotoul.fr/). Наличие генов карбапенемаз VIM, IMP и NDM определяли припомощи коммерческих наборов для ПЦР в реальном времени «MDR MBL-FL» (АмплиСенс)согласнопротоколамфирмы-производителя(ФБУН«ЦНИИэпидемиологии»Роспотребнадзора).Расчет показателя экспрессии гена oprD проводили в соответствии с международнымирекомендациями по проведению экспериментов для анализа экспрессии генов (Bustin S.A.
etal., 2009). РНК исследуемых изолятов выделяли с помощью наборов реагентов RNeasy PlusMini Kit (Qiagen) согласно протоколам фирмы-изготовителя. Реакцию ПЦР в реальномвремени проводили с помощью амплификатора LightCycler96.Для определения наличия карбапенемаз с помощью МАЛДИ-ВП МС использовалисуточную культуру P. aeruginosa, выращенную на агаре Мюллера-Хинтона (BioRad).Тестируемый изолят инкубировали в растворе меропенема (1 мг/мл) в фосфатно-солевомбуфере (pH 7,2) при 37°С в течение 3 ч. После центрифугирования раствора надосадочнуюжидкость помещали на мишень. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойнуюкислоту (DHB, от англ.
2,5-Dihydroxybenzoic acid). Спектры снимали на масс-спектрометреBiotyper Microflex (Bruker) в диапазоне 100 - 1000 Да. Параметры масс-спектрованализировали с помощью программного обеспечения flexAnalysis 3.3 (Bruker). Рассчитывалиотношение интенсивности пиков продуктов гидролиза меропенема к интенсивности пиков13нативного меропенема (процент гидролиза). Наличие карбапенемазы у тестируемого штаммаподтверждалось в случае регистрации показателей гидролиза, превышающих 5%.Для оценки продукции цефалоспориназ суточную культуру P. aeruginosa, выращеннуюна агаре Мюллера-Хинтона, суспендировали в фосфатно-солевом буфере (рН = 7,2),содержащем ZnCl2 (0,01 мг/мл), до оптической плотности 1,5 единиц по шкале МакФарланда.Полученную суспензию (0,45 мл) инкубировали с бумажным диском с нитроцефином (0,5 мг,Becton Dickinson) в течение 30 минут при 37 оС.
После центрифугирования суспензиинадосадочную жидкость переносили в лунки 96-луночного планшета (Nuclon, Thermo FisherScientific), в качестве негативного контроля использовали взвесь бактерий с бумажнымдиском, не нагруженным нитроцефином. Количественное определение продуктов гидролизанитроцефинапроводилипутемизмеренияоптическойплотностинаплашечномспектрофотометре Infinity M200 (Tecan) при длине волны 485 нм. Из полученных значенийоптической плотности (ед.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
