Автореферат (1140383), страница 2
Текст из файла (страница 2)
исоавт., 2015; Лазарева И.В. и соавт., 2016). Роль синегнойной палочки и ее резистентных формв развитии отдельных видов патологии (нозокомиальные инфекции, муковисцидоз, ожоговаяболезнь) являются предметом интереса исследовательских групп ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф.6Гамалеи» (под руководством академика А.Л. Гинцбурга), ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии»Роспотребнадзора (руководитель – академик РАН В.Г. Акимкин), ФГБНУ «НИИ вакцин исывороток им. И.И. Мечникова» (руководитель – академик В.В. Зверев), НИИ скорой помощиим. Н.В. Склифосовского (руководитель – профессор РАН С.С.
Петриков), ФГБУ «НМИЦССХ им. А.Н. Бакулева» (лаборатория под руководством д.м.н. Д.А. Попова) и другихнаучных коллективов (Калошин А.А. и соавт., 2017; Савочкина Ю.А. и соавт., 2017; ПоповД.А. и соавт., 2017; Шагинян И.А. и соавт., 2017).Приведенная информация свидетельствует о большом интересе научно-медицинскогосообщества к проблеме резистентности P. aeruginosa. Большинство отечественных работ,посвященных роли синегнойной палочки в патологии человека, сконцентрировано наэпидемиологическихвопросах,ониописываютантибиотикорезистентности клинических изолятов.лишьобщийпрофильЕсли методы определения общейчувствительности к карбапенемам у синегнойной палочки отработаны до совершенства, тооценка конкретных механизмов резистентности к этой группе представляет большуюпрактическую проблему для клинической микробиологии.
Это, прежде всего, касаетсяфенотипических методов определения бета-лактамаз, гидролизирующих карбапенемы.Многочисленныелитературныеисточники,чувствительностимикроорганизмовквключая«Экспертныеантимикробнымпрепаратам»,правилаоценкиуказывают,чтосуществующая «оценка уровней устойчивости к бета-лактамам у штаммов, продуцирующихESBL или карбапенемазы, способные расщеплять данные антибиотики, может бытьнедостаточно точной и воспроизводимой, особенно в рутинной практике». Вопросы,связанные с молекулярно-генетическими основами нарушений транспорта карбапенемоввнутрь бактериальной клетки через мембранные порины и активацией их эффлюкс-откачки,также являются малоизученными направлениями современной медицинской микробиологии.Цель исследованияЦельисследования–охарактеризоватьмолекулярно-генетическиемеханизмыустойчивости клинических изолятов Pseudomonas aeruginosa к антибиотикам группыкарбапенемов.Задачи исследования1.
Определить цефалоспориназную и карбапенемазную активность клиническихизолятов P. aeruginosa и оценить вклад цефалоспориназ и карбапенемаз в формированиеустойчивости к карбапенемам.72. Изучить структурные особенности гена oprD, а также оценить экспрессию oprDгенов у карбапенемнечувствительных изолятов P. aeruginosa и проанализировать роль поринаOprD в формировании нечувствительности к карбапенемам.3. Охарактеризовать активность RND-эффлюкс-систем у карбапенемнечувствительныхизолятов P. aeruginosa и оценить их роль в формировании устойчивости к карбапенемам.4.Провестианализсочетаниймеханизмоврезистентностиукарбапенемнечувствительных изолятов P. aeruginosa и выявить зависимость между уровнемминимальной подавляющей концентрации карбапенема и наличием механизмов устойчивостик нему.5.Обосноватьвозможностииспользованиямасс-спектрометриидляоценкикарбапенемазной активности клинических изолятов P.
aeruginosa.Научная новизнаВ составе гена oprD карбапенемнечувствительных изолятов P. aeruginosa обнаруженывставочные элементы (IS), которые ранее не встречались у представителей вида P. aeruginosa.Два типа обнаруженных у P. aeruginosa IS-элементов (ISPsme1 и ISPst2) были описаны ранееу других видов рода Pseudomonas, а один тип, ISPa195, был ранее неизвестен. Впервые вРоссии проанализирована роль нарушений структуры порина OprD и экспрессии гена oprD вформировании устойчивости к карбапенемам у клинических изолятов P.
aeruginosa.Введены понятия, по-новому характеризующие значимость цефалоспориназ в развитииустойчивости синегнойной палочки к карбапенемам. Доказано наличие закономерностей,определяющихвысокиеуровниминимальныхподавляющихконцентраций(МПК)карбапенемов у карбапенемрезистентных штаммов. Доказана возможность использованияматрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной времяпролетной массспектрометрии (МАЛДИ-ВП МС) для достоверного выявления изолятов P. aeruginosa,продуцирующих карбапенемазы.
Впервые в России проанализирована карбапенемазнаяактивность клинических изолятов P. aeruginosa при помощи МАЛДИ-ВП МС.Впервые в России у клинических изолятов P. aeruginosa была проанализированаактивность эффлюкс-зависимого выведения карбапенемов из клетки, и сделаны выводы ороли эффлюкс-систем в формировании карбапенемрезистентности.Вскрыта значимость влияния разных механизмов устойчивости на уровень МПК карбапенемов.Теоретическая и практическая значимость работыРезультаты исследования вносят существенный вклад в изучение механизмовустойчивости к карбапенемам у P.
aeruginosa и позволяют получить представление осуществовании отдельных и сочетанных механизмов устойчивости у клинических изолятов P.8aeruginosa. В работе научно обоснована и подтверждена концепция о том, что потерячувствительности к карбапенемам у синегнойной палочки в большинстве случаев являетсярезультатом комплексных структурных и/или функциональных изменений молекулярногенетического профиля бактериальной клетки. Выявлены закономерности, определяющиезависимость интенсивного гидролиза меропенема от карбапенемаз группы VIM. Изученысвязи между продукцией металло-бета-лактамаз и максимальным повышением МПКкарбапенемов у изолятов P. aeruginosa. Получено представление о многообразии мутацийгена oprD, влияющих на возникновение устойчивости к карбапенемам.
Расширеныпредставления о роли вставочных элементов, повреждающих oprD-ген синегнойной палочки,в развитии устойчивости к карбапенемам. Теоретически обоснован выбор методов оценкироли того или иного механизма в формировании устойчивости к карбапенемам приисследовании клинических изолятов P. aeruginosa.Показано,чтоиспользованныедлярешениязадачдиссертационнойработыметодические подходы являются перспективными для оценки механизмов резистентности вработе научно-исследовательских и клинических микробиологических лабораторий.
Успешноадаптирован для изучения синегнойной палочки и апробирован на клинических изолятах P.aeruginosa масс-спектрометрический метод оценки активности карбапенемаз. Установлено,что данные о наличии карбапенемаз, получаемые с помощью МАЛДИ-ВП МС, соответствуютданным,получаемымтрадиционнымиметодами(генетическимифенотипическим).Предложен протокол определения активности цефалоспориназ у P.
aeruginosa с помощьюнитроцефина для выявления штаммов с гиперпродукцией цефалоспориназ.Обнаруженный в ходе исследования новый вставочный элемент ISPa195 былзарегистрирован в базах данных GenBank и IS-finder под номером MF770250, благодаря чемуего нуклеотидная последовательность стала референсным эталоном для поиска аналогичныхвставочных элементов. Определены уровни МПК карбапенемов, обнаружение которых притестировании изолята P. aeruginosa может свидетельствовать о наличии у него конкретныхмеханизмов устойчивости к карбапенемам.Основные положения, выносимые на защиту1.Гиперпродукцияцефалоспориназ,сочетающаясясдругимимеханизмамирезистентности, и продукция карбапенемаз приводят к формированию высоких уровнейустойчивостиккарбапенемамуклиническихизолятовP.aeruginosa.Матрично-активированная лазерная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрияявляетсядостовернымметодомпродуцирующих карбапенемазы.ускоренноговыявленияизолятовP.aeruginosa,92.ГенетическираспространеннымдетерминированнаямеханизмоминактивациянечувствительностиP.поринаaeruginosaOprD,кявляяськарбапенемам,обусловлена разнообразными структурными и функциональными нарушениями oprD-гена.
Уизолятов P. aeruginosa с инактивацией OprD регистрируется более низкий уровеньрезистентности к карбапенемам, чем у штаммов, продуцирующих металло-бета-лактамазыгруппы VIM или гиперпродуцирующих цефалоспориназы.3. Гиперактивность RND-эффлюкс-систем является распространенным свойствомкарбапенемнечувствительныхштаммовP.aeruginosaиучаствуетвформированиинечувствительности к карбапенемам в сочетании с другими механизмами устойчивости,включая продукцию металло-бета-лактамаз, гиперпродукцию цефалоспориназ, нарушенияпориновой проницаемости.Методология и методы исследованияМетодология организована в соответствии с целью диссертационного исследования.Объектами исследования являлись штаммы Pseudomonas aeruginosa, резистентные ккарбапенемам. Минимальные подавляющие концентрации карбапенемов определяли припомощи метода серийных разведений.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
