Диссертация (1140232), страница 12
Текст из файла (страница 12)
1) показаны различные формы хлорофилла сразной степенью и очистки препарата (препарат 1, 3, 4, 5, 6). Эти препаратыимеют относительно слабую люминесценцию и поэтому не подошли длядиагностики и лечения, т. к. их накопление невелико в тканях и их сигналлюминесценции затруднительно диагностировать и эффективно возбудитьдля ФДТ лечения. Т.
е. для выбора предпочтительного препарата необходимобылопредварительнопроводитьисследованиеегофлуоресцентныххарактеристик, оптимально соответствующих ФИГТ технологии.На следующем рисунке показаны спектры люминесценции препаратахлорофилла (препарат 2 и 7), которые обладают наибольшим квантовымвыходом необходимым и достаточным для указанного метода лечениянеопластических и воспалительных процессов (рис. 2).76Рисунок 2.Флюоресценция препаратов РХ2 и РХ7.Для диагностики указанных хлорофилл содержащих препаратов иконтроля их поступления в ткани предварительно были выбраны оптимальныепараметры времени и мощности излучения лазера для каждой длины волны,при которых не наблюдается эффект выгорания (рис.
3-5).77Рисунок 2. А. Отсутствие изменения интенсивности флюоресценции (тушенияили выгорания флюоресценции)В) Подобраны (рис. 2, 2А и рис. 3) оптимальные параметры регистрациисигнала (мощность 2, 5 мВт и время экспозиции 50 мс) для лазера 405 нм, прикоторых эффект выгорания составляет не более 5% (применяли длядиагностики)78Рисунок 3. Подобраны оптимальные параметры регистрации сигнала(мощность и время экспозиции) для лазера 637 нм, при которых эффектвыгорания составляет не более 6% (применяются для диагностики).Были испробованы все схемы возбуждения препарата (основываясь наспектре поглощения Рис.
4) и показано, что наиболее эффективными длинамиволн для возбуждения являются волны – 405 нм и 637 нм (что полностьюсогласуется с рисунком ниже)79Рисунок 4. Спектр поглощения раствора хлорофилла в этиловом спирте сконцентрацией субстанции 0, 37 мг/мл. Красным показан пик флюоресценциисмаксимумомпри668нм,синим-при405нм.Г) Далее провели проверку суждения о том, что влияние кислорода безприсутствия лазерного облучения не приводит к изменению интенсивностилюминесцентного свечения препарата Х., т. е. не вызывает (не активирует)ФИГТ реакцию (рис.
5).Рисунок 5. Отсутствие эффекта тушения флюоресценции припродувании 02 через фотосенсибилизатор (без присутствия БО).Описание методики активации препарата.«Хлорофилл–содержащий препарат®» (ХСП) обладает способностьюпоглощать свет в видимой области, результатом чего является его фотоактивация.Классическая ФИГТ - релаксация возбужденного состояния РХ с переносом80энергии на растворенный в тканях молекулярный кислород и далее на углеродорганических субстратов.
Последнее приводит к окислительным процессам вбиологических тканях, их повреждению и последующему разрушению(некрозу). «ХСП®» способен разрушать биологические субстраты послевозбуждения светом с длиной волны 350-670 нм. Наиболее предпочтительнойдля ФИГТ полосой возбуждения является самая длинноволновая полосапоглощения РХ (662нм), т.
к. с ростом длины волны растет проникающаяспособностьсветавбиологическиеткани(до7мм).Сохраняющаяся при этом способность препарата флюоресцировать оставляетвозможность для люминесцентной диагностики очагов микробо-содержащегои\или неопластического изменения тканей. Для этого препарат возбуждают влюбую из полос – 406, 506, 536, 608 или 662нм и регистрируют максимальнуюи минимальную интенсивность флюоресценцию при 662 нм, отмечая границыпатологического очага.Моделирование объемной ФИГТ in vitroИзвестно, что для образования синглетного кислорода (1О2) необходимоналичие молекул ФС, при помощи которых происходит передача энергиифотонов молекулам кислорода (6, 7, 8).
Известно также, что эффективнымиФС образования 1О2 являются основные пигменты фотосинтеза, например,производныехлорофиллов.Синглетнымкислородом (1О2)называютэлектронно-возбужденные молекулы О2, находящиеся на одном из двухсинглетных уровней - lg+ и lg. Таким образом, 1О2 отличается от другихактивных форм кислорода (радикалов О2 -, НОО, ОН или перекиси водородаН2О2) тем, что для его получения требуется лишь поглощение энергии безхимическоймодификациикислородныхмолекул–рэлектронныемолекулярные орбитали ядра порфирина (18- -электронная ароматическаясистема) стабилизируют супероксид-анионы, образующиеся в результате81действия на ФС волновой энергии, приводя к химической устойчивостиактивированной формы ФС в течение, по крайней мере, нескольких дней.После введения ФС в организм человека они накапливаются посвойству, присущему производным хлорина Е-6, в очагах опухолевого,инфекционного, паразитарного, дерматологического, иммунологического илиаллергического заболевания, могут переносить атом кислорода, гидроксилрадикал, либо электрон как друг на друга, так и на биомолекулы оболочекпатологическиизмененныхклеток(ПИК)илимикроорганизмов.Представленные данные теоретически обосновывают предложенную намиинновационную концепцию ФИГТ.На основе представленного проводили: изучение свойств активациифотосенсибилизатора (2, 4, 5) в зависимости от длины волны лазерногоизлучения, параметров дозы облучения (2), метода доставки кислорода.Определениеоптимальныхпараметровоблучениядляполучениянаибольшего амплитудного контраста между облученным и необлученнымобразцами.
Изучение временной (рис. 6-7) кинетической зависимости эффектавосстановления люминесценции активированного препарата при отсутствиизондирующего (активирующего реакцию) его облучения и определениевремени восстановления люминесценции при различных вариантах доставкикислорода (перекись, кислород, озон).82Рисунок 6.
Активация препарата ИК-лазерным излучением (1. 06 мкм) втечение 6 минут при мощности 6 мВт (поглощенная раствором Х энергия 2, 2Дж). Отмечается уменьшение интенсивности флюоресценции практически в 7раз.83Рисунок7.Ауто-восстановлениеамплитудно-спектральныххарактеристик препарата.Такимхарактеристикобразом(свосстановлениевысвобождениемамплитудно-спектральныхактивныхформкислорода)активированного препарата хлорофилла (Х) происходит без лазерногооблучения.
Процесс наглядно представлен на рис. 6-7: черный спектр – спектрактивированного РХ (при передаче энергии 2 Дж). Зеленый спектр – этапвосстановления (через 15 минут после активации без лазерного облучения).Красный спектр – контроль (необлученный РХ). Синий спектр – спектрвосстановленного Х после 30 минут без лазерного облучения.Установлено, что выгорание люминесценции РХ: при поглощении 1 Дж– 5%, при поглощении 3 Дж – 18%, при поглощении 10 Дж – 25%.Установлено, что увеличение дозы более 30 Дж активность и интенсивностьответной реакции не увеличивает.84Изучение эффекта накопления активированного и не активированногопрепаратаХворганыиткани(мыши)Рисунок 8. Накопление активированного и\или не активированногохлорофилл-содержащего препарата в ткани (мыши).В эксперименте показана реальная возможность активации хлорофиллсодержащего фотосенсибилизатора вне БО и его накопление в органах итканях.Этопозволиловпервыеразработатьметодикуобъемнойактивированной ФИГТ микрофлоры.Методика объемной активированной ФИГТ (in vitro).Для проведения эксперимента были взяты два микроорганизма Ps.aeruginosa и S.
aureus.85В качестве основы для эксперимента был взят диско-диффузионныйметод, основанный на диффузии антибиотиков из носителя в плотнуюпитательную среду и ингибиции роста исследуемой культуры в той зоне, гдеконцентрация антибиотика превосходит МПК.Для проведения эксперимента использовали сертифицированныйаппаратно-программный комплекс-Ин Спектр М. (рис. 8).Из чистой суточной культуры Ps.
aeruginosa и S. aureus, выращенной нане селективной плотной питательной среде. С помощью дистиллированнойводы,готовилиинокулят0.5поМакФарланду,чтосоответствуетконцентрации 1×108 КОЕ/мл. Полученный инокулят наносили на МХ агар.Затемпомещалидискипропитанные(ХСП),предварительноактивированным кислородсодержащим препаратом и лазерным излучением сдлиной волны 0. 63, 0. 514, 0. 405 нм в дозе 0. 2-20 дж/мл, в концентрации 0.7%, 0. 07%, 0.
007%. В качестве контроля использовали стерильные диски,диски с не активированным препаратом (в тех же концентрациях), диски спрепаратом после воздействия на него кислородсодержащего водногораствора, диски с кислородсодержащим водным раствором (перекисьводорода 3%). Через 24 часа проводили измерение зоны задержки ростамикроорганизма.86Рисунок 9. АПК ИнСпектр МВ ходе проведенного исследования получили следующие результаты:На рисунках (9-15) видно, что при активации ХСП наблюдалосьподавление зоны роста микроорганизма через 24 часа, при этом неактивированный препарат с Ps.
aeruginosa не давал задержки зоны роста, а у S.aureus наблюдалась небольшое подавление зоны роста. При добавлении кактивированномухлорофиллсодержащемуХСПпрепаратукислородсодержащего водного раствора у Ps. aeruginosa, также наблюдалосьувеличение задержки зоны роста.Рисунок 10. Ps. aeruginosa и ХСП с Рисунок 11. Ps. aeruginosa и ХСП сдобавлением 3%H2O2,добавлением 3%H O22,активированный 20 Дж. -роста нетактивированный 20 Дж (добавлен.через 30 мин. после активации) -ростанет.87Рисунок 12. Ps.
Aeruginosa и активированный ХСП. Рис12.Аналогично для Staphylococcus aureus. Показано ФГД активированногопрепарата на микрофлору (зона отсутствия роста микрофлоры вокруг диска сактивированным препаратом 25-30 см). В центре контрольный диск безпрепарата.В результате проведенного исследования можно полагать, что придобавлении кислородсодержащего препарата к ХСП и активации еголазерным излучением с длиной волны 0. 63, 0. 514, 0. 405 нм в дозе 0. 2-20дж/мл, происходит взаимодействие возбужденного фотосенсибилизатора смолекулой кислорода.
В результате этого образуется синглетный кислород,который является цитотоксическим для живых клеток, будучи сильнымокислителем биомолекул. Синглетный кислород также образуется вфагоцитах при реакциях дыхательного взрыва. Имеются доказательствавысокойбактерициднойэффективностиактивныхформкислорода88(синглетныйкислород,радикалсупероксида,перекисьводорода,гидроксильный радикал) в отношении большинства микробов.
[11] Можнопредположить, что взаимодействие активированного ХСП с микробнойклеткой схожа с кислород-зависимой подсистемой и микробоцидной системойфагоцитов, к которой не выявлено привыкания.Таким образом, способность фотосенсибилизатора накапливаться визмененных тканях, микробных клетках с реализацией эффекта летальнойфото-сенсибилизации бактерий может быть использована при леченииантибиотико-резистентных штаммов патогенных микроорганизмов.Апробация методики объемной активированной ФИГТ прилечении опухолей (карцинома Эрлиха у мышей)В исследовании использовали 6о лабораторных мышей (из них 15контрольная группа).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
