Диссертация (1140186), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Сургитрон EMC (группа 1) (С), рабочая частота 3,8 МГц (EllmanInternational, Inc., США);2. Фотек Е80 (группа 2) (ФТ), рабочая частота 2,64 МГЦ (ООО“Фотек”, Россия);3. Radiosurg 2200 “m” (группа 3) (РС), рабочая частота 2,2 МГцMeyer-Haake GmbH, (Германия).2.1.1. Дизайн исследованияДля получения абсолютно объективных данных было запланированодвойное слепое исследование по изучению степени воздействия радиоволнразличной частоты на кожу и мягкие ткани крыс с гистологической оценкойуровня повреждения тканей и сроков заживления раны. С этой целью каждыйтип хирургического ножа был закодирован для исследователей.Эксперимент осуществили на 45 крысах породы Vistar весом 250-300г.(средний вес – 274, 6±19, 3 г). Животных разделили на 3 группы по 15 крыс,группы пронумеровали в зависимости от типа хирургического ножа: группа 1,группа 2, группа 3.Перед операцией животных обезболили подкожным введением 10%кетамина и 2% ксилазина в соотношении 3/1 в дозе 0,2 мл/ 100 г.
массы тела.Крыс фиксировали и в стерильных условиях выполняли по 4 разреза кожи иподкожной клетчатки длиной 1,5 см в определенных зонах поверхностиспины.Спомощьювысокочастотныхрадиоволновыхножейразных32производителей выполняли три разреза, затем все раны зашивали викрилом4/0.Через 3, 7 и 14 суток по 5 животных в каждой группе выводили из опытапередозировкой наркорена. Для проведения гистологического исследованияобласти кожи и подкожной клетчатки с ранами вырезали участки размером 2 х3 см и помещали в 10% раствор нейтрального формалина.2.1.2.
Материал и методы морфологического и иммуногистохимическогоисследованияВо всех 3-х группах крыс провели гистологическое исследованиезаживления кожных ран на 3,7 и 14 сутки со времени проведения рассечения.Полученный в ходе эксперимента материал фиксировали в 10%нейтральном формалине и заливали в парафин по стандартной методике.Серийные парафиновые срезы толщиной 4мкм окрашивали гематоксилином иэозином для гистологического анализа.Для иммуногистохимического исследования готовые срезы переносилина высоко адгезивные стекла и сушили при температуре 37°С в течение 18часов или 2 часа при 50°С.
После снятия парафина со срезов с помощьюксилола, анализируемые образцы тканей регидратировали последовательно вспиртах 95о, 80о 70о, выдерживая в каждом растворе по 3 минуты. Антигеннуюактивность восстанавливали инкубацией срезов в PT Link («Dako») притемпературе 97°С в течение 15 мин. в 10 мМ цитратном буфере рН 6,0. Затемсрезы охлаждали в буфере PBS в течение 20 минут и помещали во влажныекамеры (для предотвращения высыхания срезов), где проводили 15 минутреакцию с3%-ным раствором перекиси водорода для блокированияэндогенной пероксидазы.
Для проведения реакции с антикрысинымиантителами к коллагену 1 типа (Сollagen I) и коллагену 3 типа (Сollagen III)проводили дополнительное выдерживание срезов в ферментном раствореPronase reagent (Gene Tex, USA) в течение 10 минут при комнатной33температуре. Кроме того, для блокирования неспецифического белковоговзаимодействия на срезы наносили белковый блок (Thermo scientific, USA) на10 минут. Затем, не промывая срезы буфером, проводили реакцию спервичными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре. Вработе были задействованы антитела к Ki-67 (1:100) - кроличьи антикрысиныемоноклональные, клон SP6 (Abcam, UK),CD34(1:100) - кроличьиантикрысиные моноклональные, клон EP373 Y ( Abcam, UK), Col I (1:200) –мышиные антикрысиные моноклональные, клон COL-1 (Abcam, UK), Col III(1:600) - мышиные антикрысиные моноклональные, клон FH-7A ( Abcam, UK).Для того, чтобы увидеть места связывания антител с антигенами выбралинабор Histofine Simple Stain Rat MAX PO(MULTI) (Nichirei Biosciences,Япония), созданный для проведения иммуногистохимического (ИГХ) анализаткани крыс.
Конечным продуктом проведения ИГХ реакций было появлениеводонерастворимого осадка коричневого цвета, который образовывался врезультате окисления субстрата 3,3-диаминобензидина (ДАБ) пероксидазойхрена.Для адекватной трактовки результатов ИГХ анализа проводилиположительные и отрицательные контрольные реакции. Отрицательнымиконтролями служили образцы исследуемых срезов, которые проходилистандартную методику иммуногистохимического анализа, но без добавленияпервичных антител. Положительные контроли для каждого антитела выбиралив соответствии с рекомендациями фирм-производителей. ИГХ анализзавершали контрастированием срезов гематоксилином и заключением их всинтетическую среду «Shandon mount TM» (USA).2.1.3. Методы оценки полученных результатовГистологические изменения в ткани крыс, произошедшие во времязаживленияран,гематоксилиномиоценивалинасрезах,которыеэозином,последующимбылиокрашеныкритериям:во-первых,выраженность повреждения в виде некроза ткани; во-вторых, кровоизлияние;34в-третьих,воспалительнаяреакциянарассечение(лейкоцитарнаяинфильтрация); в-четвертых, неоангиогенез; в-пятых, репарация эпителия исоединительной ткани.Данные изменения давали возможность понять, на какой стадиирепаративного процесса находилась кожная рана, а именно:1 стадия – рана заполнена кровяным сгустком и наблюдается воспалительнаяреакция в прилежащих сохранных тканях;2 стадия – рана заполнена молодой грануляционной тканью и начинаетсяэпителизация ;3 стадия - рана заполнена зрелой грануляционной тканью и произошлаполностью эпителизация поверхности;4стадия–сформированрубецисоединительнаятканьпрошларемоделирование.Репаративные процессы были проанализированы также с помощьюиммуногистохимическихметодовнасерийныхпарафиновыхсрезах.Сопоставление уровней экспрессии белков коллагена I и III типов, а такжедругих гистоморфологических параметров (наличие воспалительной реакции,ангиогенез и т.д.) проводили с помощью полуколичественного метода оценкиинтенсивностиокрашиваниядиаминобензидином (ДАБ).препаратов(бальнаясистемасчета)При слабой окраске экспрессия маркераоценивалась в 2 балла, при умеренной – 4, при высокой – 6, при очень высокой- 8.
Для оценки уровня экспрессии маркера клеточной пролиферации Ki-67 втканях в зоне регенерации раны считали процент положительно окрашенныхядер эпителиальных клеток в нескольких полях зрения. Для полного анализаполученных данных результаты обрабатывали с помощью статистическихметодов для малых выборок с помощью критериевСтьюдента.Манна- Уитни и352.2. Материал и методы клинической части2.2.1.
Общая характеристика пациентов и методы обследованияРаботу выполнили на базе кафедрыхирургическойстоматологииРУДН,челюстно-лицевой хирургии икотораянаходитсявотделениичелюстно-лицевой хирургии НУЗ ЦКБ № 2 им. Н.А. Семашко ОАО «РЖД», вчастных медицинских центрах ООО “Мединкур” и ООО “Клиника профессораЮцковской”. За период с 2005 по 2015 год было обследовано ипрооперировано 429 пациентов с различными новообразованиями кожи шеи,лица, век и волосистой части головы.
Наибольшее количество пациентов было– 165 с невусами кожи лица, 64 с папилломами век, 46 с кератомами лица, 36 сневусами кожи шеи, 34 с атеромами волосистой части головы, 16 с атеромойкожи лица,4 с атеромами шеи, 4 с кожным рогом, 3 с липомами лица, 3 скапиллярной гемангиомой. Особое внимание уделили пациентам с ринофимой(54 человека). Причем, с фиброзной формой ринофимы было 21 человек, сгландулярной формой – 33 человека.С различной патологией слизистой оболочки полости рта былопролечено 193 пациента в возрастном диапазоне от 19-ти до 69-ти лет.Ретенционная киста слизистой оболочки нижней губы была у 23-х пациентов,фиброматозный эпулис – у 20-ти пациентов, ангиоматозный эпулис – у 4-хпациентов, гипертрофия маргинальной десны – у 43-х пациентов, фибромаслизистой оболочки – у 26-ти, фиброма языка – у 4-х.
Наибольшее количествопациентов пролечили с диагнозом перикоронит - 73 человека (Табл.1).В нашем исследовании пациентов с ринофимой выделили в отдельнуюгруппу в связи с тем, что данное новообразование имеет широкое основание ипри операции по удалению образуется рана большой площади, которая долгои тяжело заживает. Известно, что применение традиционной хирургии прилечении ринофимы не дает хорошего эстетического результата, в то время какиспользование радиоволнового скальпеля позволяет ране зажитьТаблица 1.
Распределение пациентов по полу и возрасту.36пол61-70 летНовообразования кожи головы и шеи.М000270 и болеелет14319ЖМ0000000222105228ЖМ00040210400056ЖМ1063350300001011Атерома кожи шеиЖМ207251501010213Липома лицаЖМ00001000000010Невус кожи лицаЖМ01403908231300367Невус кожи шеиЖМ240346271705000987Папиллома векЖМ8413157191302002943Кератома кожи лицаЖМ201147120816042134Кожный рогЖМ000010029120123Капиллярная гемангиомаЖМ00000010000010Ж0012003Ретенционная кистаМ4230009Фиброматозный эпулисЖМ7050260600001412Ангиоматозный эпулисЖМ00003052000082ПерикоронитЖМ0190210100000221ЖМ491350100200005218ЖМЖМЖ30000821009480157412000000000025131313Фиброзная формаринофимыГландулярная формаринофимыАтерома кожи лицаАтерома волосистой частиголовы19-30 лет31-40 лет41–50 лет51-60 летПатология слизистой оболочки полости рта.Гипертрофия маргинальнойдесныФиброма слизистойоболочкиФиброма языкаВсего:37без грубого рубцевания.
Большая раневая поверхность, которая появляетсяпосле операции по иссечению ринофимы, дает прекрасную возможностьоценитьпреимущества работы радиоволновым скальпелем на коже лица.Именнопоэтомуклиническуюоценкупослеоперационноготеченияпроводили только у пациентов с ринофимой. Обследование пациентов сдиагнозом«ринофима»проходилапоследующейсхеме:пациентовнаправляли на стандартные исследования, включающие в себя общий анализмочи; общий анализ крови; коагулограмму; анализы на RW; ВИЧ; HBs; HCV.Послесдачианализовпациентыконсультировалисьутерапевтаинаправлялись на хирургическое лечение.Кроме того, выделили особо пациентов с затрудненным прорезываниемтретьих моляров, потому что данная патология относится к воспалительнымзаболеваниям и послеоперационный период характеризуется большимиособенностями.
Обследование этой категории пациентов включало в себяопрос, клиническое и рентгенологическое обследование. При сборе анамнеза иклиническом обследовании выявляли выраженность боли, длительностьзаболевания, наличие искажений конфигурации лица, степень ограниченияоткрывания рта, состояние регионарных лимфатических узлов. Затемвыявляли степень прорезывания третьих моляров, наличие или отсутствиегноя из-под слизистого капюшона, выраженность гиперемии и отекаслизистой оболочки в области прорезывания. Было важно оценить состояниечелюстно-язычного желобка для исключения абсцесса данной области.Следующим этапом было рентгенологическое обследование.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
