Диссертация (1140095), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Далееплазма хранилась при – 40’C в морозильной камере SANYO (-80'C) не болеемесяца.Согласно инструкции к набору, нормальным значением PF4 считается от 2 до95 МЕ/мл.Для количественного определения уровня Д-димера применялся наборTechnozym D-dimer Elisa фирмы Technoclone (Австрия), согласно инструкциифирмы изготовителя. Кровь забиралась в пробирку с цитратом натрия (9:1) и45центрифугировалась 20 минут при 3000g. Далее плазма замораживалась при – 40’Cи хранилась менее месяца до исследования.Диапазон нормальных значений Д- димера определен как 0- 250 нг/мл.2.3. Определение фибринолитической активностиДля определения фибринолитической активности плазмы крови применялсянабор “XIIа зависимы фибринолиз” производителя Ренам (Россия).Тест основан на измерении времени полного лизиса эуглобулиновойфракции, полученной из плазмы крови при осаждении в кислой среде исодержащей факторы свертывания крови и фибринолиза.
Из плазмы кровивыделяют эуглобулиновую фракцию, содержащую плазминоген, фибриноген,факторы свертывания и не содержащую ингибиторов фибринолиза; придобавлении хлористого кальция образуется сгусток фибрина, который лизируетсяплазмином в течение 5- 12 минут. Реакция активируется фактором XIIа. Время отмомента образования сгустка до его растворения отражает фибринолитическуюактивность исследуемой плазмы человека.Для исследования кровь собиралась в пробирку с цитратом натрия 3,8% иподвергалась двойному центрифугированию в течение 7 минут при 240g и 15 минутпри 1200g. Плазма замораживалась при -40’C и хранилась менее месяца доисследования.Определениефибринолитическойактивностивыполнялосьсогласноинструкции фирмы изготовителя. Нормальным значением XIIа зависимогофибринолиза считается 5- 12 минут.2.4.
Генетическое исследование тромбофилийДНК-диагностику осуществляли в группе исследования и коррекции геномачеловека в лаборатории биотехнологии Института Биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова (руководитель – д.б.н., профессор Патрушев46Л.И.). Исследование проводилось д.б.н. Патрушевым Л.И. и коллегами. ДлядиагностикимутационныхизмененийприменялиДНК,выделеннуюизпериферической крови стандартными методами. Использованные методы ДНКдиагностики были основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Первичныйскрининг мутации Leiden осуществляли по методу R.M.Bertina с соавторами(1994г.) и рестриктазой Mnl 1.
Мутацию G20210A в гене протромбина определялис помощью рестриктазы Taq 1 после введения в продукт ПЦР искусственного сайтарестрикции. Первичный скрининг мутаций С677Т осуществляли с использованиемрестриктазы Hinf 1, сайт рестрикции которой возникает под действиемсоответствующей мутации. Аллельное (гомозиготное или гетерозиготное)состояние выявленной мутации подтверждали с помощью аллель- специфическихпраймеров.Кровь в количестве 5 мл получали методом венопункции в одноразовуюстерильную пробирку с антикоагулянтом. В качестве антикоагулянта использовали0,5 М раствор EDTA в соотношении антикоагулянт: кровь 1:10. Кровь хранили при-20˚-80˚C до выделения ДНК.
ДНК выделяли из лимфоцитов периферическойкрови с помощью наборов реактивов Diatom DNA Prep 200, основанных наиспользовании гуанидинтиоционата и Nucleus–сорбента (Isogene Lab.Ltd, Россия)в соответствии с методикой, разработанной фирмой-производителем.Длявыявлениямутацийприменялисьоригинальныетест-системы,разработанные в Институте биоорганической химии им.
академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, основанные наполимеразной цепной реакции (ПЦР).2.5. Инструментальные методы обследованияПациентам с ХОБЛ, которым проводилась спирометрия (на базе городскойполиклиники), дополнительно оценивались спирометрические показатели сиспользованием портативного прибора- “COPD-6” Vitalograph Model 4000.47Рентгенографическое исследование выполнялось в рентгенологическом отделенииполиклиники. Компьютерная томография легких назначалась при наличиипоказаний к ее проведению.Пациентам с атеротромбозом для подтверждения диагноза проводились ЭКГ,эхокардиография и коронароангиография.2.6. Статистическая обработка материалаСтатистический анализ выполнялся с использованием программы Statistica10.0 [18].
Применялись методы описательной статистики, непараметрическиеметоды. Статистическая значимость показателей была определена как р <0,05.Если значение p было меньше 0,001, то p указывалась в формате “p<0,001”.Проводилась проверка нормальности распределения количественных признаков.Для проверки статистических гипотез о виде распределения был применёнкритерийShapiro-Wilk’sW.Приописаниицентральныхтенденцийколичественных признаков, имеющих приближенно нормальное распределение,указывались среднее значение (М) и среднее квадратическое отклонение (SD), приописании признаков, не имеющих нормального распределения, применялисьмедиана (Ме) и интерквартильный размах [25-й и 75-й процентили]. Результатыдля качественных признаков представлены как абсолютное количество и процентот общего числа.Присравнениинезависимыхгрупппоколичественномупризнакуиспользовались критерии Манна-Уитни (2 группы), Н- критерий Краскела-Уоллиса(несколькогрупп)иДаннадляпопарногомножественногосравнения.Качественные показатели в 2-х несвязанных группах сравнивались в таблицесопряженности 2х2 с помощью теста χ2, при количестве наблюдений менее 5применялсяточныйкритерийФишера.Взаимосвязьоценивалась методом ранговой корреляции по Спирмену (r).междупризнаками48ГЛАВА 3РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ3.1.
Показатели интенсивности внутрисосудистого микросвертываниякровиВ ходе работы было обследовано 115 пациентов: 37 пациентов с ХОБЛ (22 стромбофилиями, 15 – без); 37 пациентов с атеротромбозом (23 с тромбофилиями,14 без), 41 пациент с ХОБЛ и атеротромбозом (24 с тромбофилиями, 17- без).Каждая из групп подразделялась в зависимости от наличия или отсутствиятромбофилии.
В группу контроля вошли 53 практически здоровых человека, изкоторых 39 имели тромбофилию и 14 без таковой.Проводился анализ на наиболее часто встречающиеся тромбофилии: FVL,дефект молекулы протромбина (протромбин А-20210), PAI-1 (-675) и MTHFR (-677).Увсехнаблюдавшихсябольныхбылаизученаинтенсивностьвнутрисосудистого микросвертывания крови, а именно, уровень PF4, Д-димера ифибринолитическая активность (XIIа-зависимый фибринолиз).Для определения разницы в уровнях PF4, Д-димера и фибринолитическойактивности в исследуемых подгруппах пациентов применялся непараметрическийН- критерий Краксела- Уоллиса и Данна для попарного множественного сравнения.3.1.1.
Уровень PF4 у больных ХОБЛ и атеротромбозом в зависимости отналичия тромбофилииДанные исследования уровня PF4 представлены в таблице 19, рисунок 2.49Таблица 19- Распределение больных по уровню PF4 в группахПок-ль12345678ХОБЛХОБЛАТАТХОБЛ+АТХОБЛ+АТЗдЗдСБезСБезСБезСБезn=22n=15n=23n=14n=24n=17n=39n=14Ме103,591,5127,1103,7136,5108,991,379,4(МЕ/мл)(90,8,(68,4,(119,6,129,6)(96,2,107,2)(123,1,(98,5,(73,3,(72,3,124,6)106)143)115,9)103,3)93,3)83,548133,276,1145,393,250,633,11837720,530641065,5348815851972464СреднийрангСуммаранговpp=0,028р <0,001р <0,001nsПримечание: Ме (25,75) - медиана (интерквартильный размах), ns – незначимо.
р7/1=0,004, р7/3, 7/5<0,001, р8/2=ns, р8/4, 8/6<0,001Различия в группах по уровню PF 4 имеются при H критерии КракселаУоллиса =104,6 уровень значимости p <0,001.В контрольной группе (Зд) средний ранг PF4 составил 50,6 с тромбофилиямии 33,1 без. Статистической значимости между показателями не обнаружено, однаков подгруппе с тромбофилией показатель выше.Согласно инструкции к набору, нормальным значением PF4 считается от 2 до95 МЕ/мл, что и отмечается у контрольной группы. Медиана в подгруппе стромбофилией соответствует 91,3 МЕ/мл и 79,4 МЕ/мл без.У пациентов в группе ХОБЛ средний ранг PF4 составил 83,5 с тромбофилиямии 48 без, что является статистически значимой разницей (р=0,028).
У пациентов вгруппах АТ (133,2 и 76,1) и ХОБЛ+АТ (145,3 и 93,2) отмечалась максимальнозначимая разница (p <0,001) в уровне PF4 между подгруппами с и без тромбофилии.При сравнении с контрольной группой уровень PF4 у больных с тромбофилиями50значимопревышаливозрастал“Здоровые→ХОБЛ→АТ→ХОБЛ+АТ”следующимобразом:(50,6→83,5→133,2→145,3).Уровеньзначимости между контрольной группой и ХОБЛ с тромбофилиями составлялp=0,004. При этом, у пациентов с ХОБЛ без тромбофилии уровень PF4 был выше,чем у контрольной группы, но статистически не значимо, однако он также возрасталвряду“Здоровые→ХОБЛ→АТ-ХОБЛ+АТ”(33,1→48→76,1→93,2).Статистическая значимость между подгруппами пациентов без тромбофилийотмечается при сравнении контрольной группы с подгруппами пациентов с АТ(p<0,01), ХОБЛ+АТ (p <0,01).Диаграмма размаха по группамуровень PF4160140120PF4МЕ/мл1008060401нг234567Группы8Median25%-75%Min-MaxРисунок 2- Уровень PF4Примечание: 1-здоровые, 3- ХОБЛ, 5- АТ, 7- ХОБЛ+АТ с тромбофилиями2-здоровые, 4- ХОБЛ, 6- АТ, 8- ХОБЛ+АТ без тромбофилий513.1.2.
Уровень Д-димера у больных ХОБЛ и атеротромбозом в зависимостиот наличия тромбофилииДанные исследования уровня Д-димера представлены в таблице 20, рисунок 3.Таблица 20- Распределение больных по уровню Д-димера в группахПок-льМе (нг/мл)Средний12345678ХОБЛХОБЛАТАТХОБЛ+АТХОБЛ+АТЗдЗдСБезСБезСБезСБезn=22n=15n=23n=14n=24n=17n=39n=14706196,972,5106,579,36051,1(64,1, 95)(40,5,(89,(65,(92,8,(69, 87)(42,2,(44,2,75)101)78,5)113,3)72)64,9)81,947133,575,9145,393,151,733,5180270530701063348715832016468рангСуммаранговpp=0,023р <0,001р <0,001nsПримечание: Ме (25,75) - медиана (интерквартильный размах), ns – незначимо. р7/1=0,006, р7/3, 7/5<0,001, р8/2=ns, р8/4=0,028, р8/6<0,001Различия в группах по уровню Д-димера имеются при H критерии КракселаУоллиса =103,9, где уровень значимости p <0,001.В группе контроля (Зд) средний ранг Д-димера составил 51,7 стромбофилиями и 33,5 без.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
