Диссертация (1140073), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Недостаточноизучено влияние различных видов стресса и ответ на эти стрессоры организмав самом раннем постнатальном онтогенезе.47ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫИсследование выполнено на 48 крысах породы Спрег-Доули в возрасте20 и 45 суток, что соответствовало инфантильному и перипубертатномупериодам постнатального развития.
На момент окончания экспериментавозраст был 28 и 53 суток соответственно. В каждой возрастной группе,включающей 24 особи, животных подразделяли на 3 подгруппы: контрольнуюи 2 экспериментальные для моделирования хронического гомотипического игетеротипического стресса.воздействияприменялсяВ качестве гомотипического стрессорногостресс«избеганияводы»,авкачествегетеротипического — использовалась непредсказуемая последовательностьдействиятрехстрессоров:«избеганияводы»,воднойиммерсииииммобилизации при температуре 4 °С.
Животных содержали в стандартныхусловиях вивария при температуре +20°С с доступом к воде и пище ad libitum.Экспериментальных животных ежедневно на протяжении 9 суток по 2 ч вдень, начиная с 9 ч утра, подвергали стрессорному воздействию, в то времякак животные групп возрастного контроля находились вне аудио- и видеодосягаемости от экспериментальных животных. После последнего сеансастресса животных под анестезией декапитировали, селезенку извлекали,фиксировали формалином и заливали в парафин.Гистологические срезы селезенки окрашивали гематоксилином эозином и иммуногистохимически поликлональными антителами к белкуS100 (Дако, Дания, Z0311), а также моноклональными антителами к PCNA(клон PC 10) - ядерного антигена пролиферирующих клеток (AbDSerotec,США, MCA 1558); CD4 (клон W3/25) - маркеру Т-хелперов и тимоцитов(AbDSerotec, США, МСА55); CD8 (клон MRC ОХ8) - маркеру тимоцитов, Тклеток и NK-клеток (AbDSerotec, США, МСА48), CD90 (клон HIS51) маркеру тимоцитов, недавних тимусных иммигрантов (BD Biosciences,550570), каспазы-3 - маркеру апоптоза (AbDSerotec, США, AHP476), 0X62(клон MRC 0X62) - маркеру дендритных клеток (AbDSerotec, США, MCA481029); CD20 (клон R1N- 9D3) - маркеру пре- и зрелых В-лифмоцитов(AbDSerotec, МСА 1432).Для визуализации применяли стрептавидин-биогин - пероксидазныйметод по стандартным методикам в соответствии с рекомендациямипроизводителей реактивов.
Удельные площади иммунопозитивных клеток,окрашенныхдиаминобензидиномвкоричневыйцвет,оценивалиморфометрически с применением программы Image-Pro+ 8.0 (MediaCybernetics, США), транспортирующей цифровые данные в программу Excel.Определяли среднюю арифметическую величину, среднеквадратическоеотклонение, ошибку репрезентативности. Оценку значимости различийсравниваемых величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента.Критическим уровнем значимости считали р<0,05.49ГЛАВА 3.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ3.1. Морфометрический анализ селезенки крыс инфантильного иперипубертатного периодов онтогенезапри воздействии гомо- игетеротипического стрессаС четвертой недели жизни у крысиммуннойсистемы,ипреждеотмечается динамичное развитиевсего,селезенки.Изучениенамигистологического строения селезенки животных контрольной группы сисходным возрастом 20 суток показало, что в селезенкекрыс этоговозрастного периода наблюдалось преобладание белой пульпы, чтохарактеризовалось расширением ПАЛВ, увеличением размеров лимфоидныхузелков и герминативных центров в лимфоидных узелках.
Отмечалосьумеренное количество клеток с фенотипом недавних тимусных иммигрантовCD90+: они по большей части были локализованы в наружной зоне ПАЛВ,частично– в маргинальной зоне и в красной пульпе. Определялось небольшоечисло CD8+ клеток, главным образом в ПАЛВ. Большинство CD8+ клетокрасполагалоськонцентрациявпериартериальныхбыланескольколимфоидныхвышеувлагалищах,контрольныхихживотныхперипубертатного возраста; незначительное количество CD8+ клеток былолокализовано в красной пульпе, практически единичные клетки -вмаргинальной зоне.Хронический стресс при действии как гомо-, так и гетеротипическихстрессоров вызывал выраженные изменения в селезенке. Они заключались визменении объема Т- и В-зон белой пульпы, маргинальной зоны,расположения клеток как в Т-зонах (периартериальных лимфоидныхвлагалищах), так и в В-зонах (лимфоидных узелках).
Полученные данныеморфометрического анализа отражены в рис 1.50Рисунок 1. Изменения микроморфологической картины селезенки контрольныхи экспериментальных животных после воздействия гомотипического игетеротипического стресса.Селезенка крыс перипубертатной (а-г, ж, з) и инфантильной (д, е) возрастных групп вконтроле (а, в, д, ж) и после гомотипического (б) и гетеротипического (г, е, з) стресса.а, б –реакция на СD8+, в, г- реакция на CD90+, д, е - реакция на OX62+, ж, з - реакция на PCNA51Сразу после окончания стрессорного воздействия наблюдалось резкоеуменьшение клеточности в белой пульпе селезенки, уменьшение объема Тзон (периартериальных лимфоидных влагалищ селезенки), редукция В-зон,активация процесса апоптоза, которая проявлялась повышением количествамакрофагов с неокрашенной цитоплазмой, захвативших апоптозные тельца,которые накапливались как в В-зонах, так и в Т-зонах.
Эти изменения былиболее выражены в Т-зонах животных инфантильного возраста и В-зонах крысперипубертатного возраста.В селезенке контрольных животных CD8+клеткирасполагалисьравномерно, с концентрацией в периартериальных лимфоидных влагалищах,плотность CD8+клеток была несколько выше у животных перипубертатноговозраста; меньшее число этих клеток накапливалось в красной пульпе,незначительное количество - в маргинальной зоне, в лимфоидных узелках ониотсутствовали. После стресса их доля в периартериальных лимфоидныхвлагалищах резко уменьшилась и у контрольных и у экспериментальныхживотных всех возрастных групп. Этому соответствовало общее уменьшениеобъема Т-зоны селезенки.Уменьшение количества CD8+ клеток в маргинальной зоне и ПАЛВзависело от характера и выраженности стрессорного воздействия: пригетеротипическомстрессесовсемнезначительноеколичествоиммунореактивных клеток определялось во внутренней зоне ПАЛВ, пригомотипическом стрессеиммунореактивные клеткиобнаруживалисьвсконцентрированнымивнаружной зоне ПАЛВ и в маргинальной зоне.CD90-позитивныеклеткиопределялисьосновном в Т-зонах, единичные клетки встречались в селезеночных тяжах.После воздействия стрессаони практически исчезлииз белой пульпы,особенно у животных инфантильной группы.
Число СD90+клеток снижалосьв зависимости от вида стресса: при гомотипическом стрессе в наружной зонепреимущественно крупных ПАЛВ присутствовало небольшое число клеток, а52при гетеротипическом стрессе у крыс инфантильного возраста в ПАЛВ иселезеночных тяжах персистировали единичные клетки.При окрашивание на СD20 отмечалось яркое окрашивание и высокаяплотность клеток в лимфоидных узелках и по убывающей в маргинальнойзоне и красной пульпе селезенки.
Стресс вызвал опустошение лимфоидныхузелков селезенки из-за резкого снижения в них числа иммунореактивныхклеток; в меньшей степени это касалось маргинальной зоны и селезеночныхтяжей у животных обеих возрастных подгрупп.Окрашивание на белок S100 показало, что после стрессорноговоздействия сеть стромальных клеток лимфоидных узелков селезенки,оказалась практически полностью разрушенной, особенно выраженными этиизменения были при воздействии гетеротипического стресса.Отличиемявлялось то, что у животных исходного перипубертатного возраста в целомлимфоидных узелков было больше, они отличались большими размерами вбольшинстве из них определялись вторичные лимфоидные узелки, всравнении сживотными исходного инфантильного возрастау которыхпервичные лимфоидные узелки были мельче, и малочисленнее, а вторичныелимфоидные узелки практически отсутствовали.Каспаза-3-иммунореактивные клетки содержались в селезенке – большев белой пульпе, чем в красной пульпе, причем больше в В-зонах, чем в Ткомпартментах,иувеличениеихдолибылозаметновышепригетеротипическом стрессе у животных перипубертатной экcпериментальнойгруппы.При окраске на PCNA площадь иммунореактивных клеток в ПАЛВснижалась умеренно в инфантильной группеи резко –у животныхперипубертатного возраста.
Снижение количества иммунореактивных клетокв лимфоидных узелках сопровождалось их разрушением и практическиполным исчезновением.533.2. Имидж анализ селезенки крыс разных возрастных групп привоздействии гомо- и гетеротипического стрессаДля объективизации наблюдений был проведен цифровой анализизменений в селезенке, позволивший выявить наиболее информативныекритерии оценки постстрессовой динамики различных клеточных популяций.Результаты морфометрии получены при обработке срезов селезенки, гдезначительная площадь среза позволяла с помощью заданного шагапроизвольно выделять требуемых 5 полей зрения для имидж-анализа.Удельная площадь CD4+иммунореактивных клеток в селезенкеконтрольных крыс инфантильного возраста составила 16.25± 1.47%,перипубертатного возраста - 18.34± 1.62 %.
В экспериментальной группепослевоздействиягомотипическогострессаудельнаяплощадьCD4+иммунореактивных клеток у крыс инфантильного возраста составила11.09± 1.18%, что достоверно отличалось от показателей контрольных крыссоответствующего возраста (p < 0,01).У животных перипубертатноговозраста динамика была менее выражена, но также статистически значима,содержание CD4+иммунореактивных клеток снизилось до 13.09±1.44% (p <0,05).Послевоздействиягетеротипическогострессораизмененияисследуемых параметров по сравнению с контрольной группой оказались ещеболее выраженными, особенно у экспериментальных крыс инфантильноговозраста. Установленозначительное уменьшение удельной площадиCD4+иммунореактивных клеток у крыс обеих возрастных групп , котораясоставила 9.76±1.14% и 11.91± 1.21% соответственно (p < 0,01) (рис.
2)5425,0020,00Контроль*15,00****Гомотипический стрессорГетеротипический стрессор**10,005,000,00IIIРисунок 2. Удельная площадь CD4+ иммунореактивных клеток вселезенке контрольных и экспериментальных животных (¯x±S¯x)По горизонтальной оси: I – инфантильный возраст; II – перипубертатный возраст;исследованный показатель (%). Различия по сравнению с контролем значимы:* при Р < 0,05; ** при Р < 0,01;.
Вертикальные отрезки – значения стандартной ошибки.Изучение воздействия гомо - и гетеротипических стрессоров наCD8+иммунореактивныеклеткивселезенкеконтрольныхиэкспериментальных крыс продемонстрировало похожие тенденции. УдельнаяплощадьCD8+иммунореактивных клеток в селезенке контрольных крысинфантильного и перипубертатного возраста составила 19.98± 1.67 % и 19.98±1.67%соответственно. Воздействие гомотипического стресса привело кдостоверному снижению удельной площади CD8+иммунореактивных клетокдо 14.05± 1.39% у крыс инфантильноговозраста (p < 0,01). У крысперипубертатного возраста уменьшение доли CD8+ лимфоцитов на фонегомотипического стресса было менее отчетливым, но достигло степенистатистической достоверности и составило 17.13± 1.87% (p < 0,01).
Поддействием гетеротипического стресса произошло снижение удельнойплощади CD8+иммунореактивных клеток в селезенке контрольных крыс и55инфантильного, и перипубертатного возраста высокой степени достоверности,доля CD8+ лимфоцитов в этой подгруппе составила 12.53± 1.32% и 14.35±1.41% соответственно (p < 0,01) (рис. 3).Рисунок 3.
Удельная площадь CD8+ иммунореактивных клеток вселезенке контрольных и экспериментальных животных (¯x±S¯x)По горизонтальной оси: I – инфантильный возраст; II – перипубертатный возраст;исследованный показатель (%). Различия по сравнению с контролем значимы:* при Р < 0,05; ** при Р < 0,01. Вертикальные отрезки – значения стандартной ошибки.Таким образом, хронический стресс, как гомо-, так и гетеротипический,вызывал достоверное уменьшение удельной пощади как Т-, так и B-клеточныхпопуляцийв обеихвозрастныхподгруппах,причемпридействиигетеротипических стрессоров это снижение было более выраженным, сразным уровнем значимости различий у двух стресс-групп и у отдельныхсубпопуляций лимфоцитов. Доля CD8+ и CD4+ лимфоцитов снижаласьдостоверно в обеих экспериментальных группах с большим уровнем различиймежду двумя экспериментальными группами у животных перипубертатногопериода, чем у крыс инфантильного возраста.56При изучении динамики количества CD90+ и CD20+ лимфоцитов при обоихвидах стресса выявлены однонаправленные тенденции (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
