Диссертация (1140070), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Гистоферментохимический метод.Заморозка биопсийного материала осуществлялась в жидком азоте. Насрезах ткани толщиной 10 и 20 мкм, полученных с использованиеммикротома-криостата Microm HM 505 N, было проведено гистохимическоевыявлениеактивностисукцинатдегидрогеназыметодом(СДГ)снитросиним тетразолием по Нахласу [Пирс, 1962]. Оценка выраженностигистоферментохимическихизмененийактивностимитохондрийвмышечных волокнах I типа (количества и выраженности RRF) проводилась побалльной системе [Сухоруков, 1998]:1 балл RRF - умеренные субсарколеммальные скопления метки;2баллаRRF-умеренныемежмиофибриллярные скопления метки;субсарколеммальныеиумеренные403баллаRRF-грубыесубсарколеммальныеиумеренныемежмиофибриллярные скопления метки;4 балла RRF - грубые субсарколеммальные и грубые межмиофибриллярныескопления метки.Также был рассчитан интегральный количественный показательмитохондриальной дисфункции - «митохондриальный индекс» [Сухоруков,1998](Таблица4),представляющийсобойсуммубалловвыявленныхморфологических параметров, разделенную на количество этих параметров.Таблица 4.
Морфологические критерии определения митохондриальногоиндекса.Митохондриальный индексБаллыRRF слабые2RRF значительные5Слабое снижение СДГ3Сильное снижение СДГ5Слабое снижение СОХ3Сильное снижение СОХ5RRF 5-10%2RRF 10-30%3RRF 30-50%4RRF более 50%5412.2.3.2. Метод флуоресцентной иммуногистохимии.Послевзятиябиопсиибылапроведенахимическаяфиксацияматериала в 10% нейтральном (рН-7,4) забуференном формалине в течение24 часов, после чего материал был обработан по стандартной методике сиспользованием ксилола и залит в парафин.
С парафиновых блоков былиполучены срезы толщиной 4мкм, которые были нанесены на высокоадгезивные стекла, а затем высушены в течение 24 часов при температуре48°С.Для каждого клинического случая было получено три препарата: один- для окраски антителами к наружной митохондриальной мембране и кмитохондриальным комплексам IV и V; второй препарат - для примененияантител к наружной митохондриальной мембране и к белку MTHSP70;третий препарат - для визуализации наружной митохондриальной мембраныи фактора HIF-1α.Была применена модифицированная методика, предложенная De Paepe B. etal.(2009a). Срезы были депарафинированы поочередно в трех ксилолах по 5минут в каждом, регидрированы трехкратно в 96% спиртовых растворах по5 минут в каждом, промыты в дистиллированной воде 3 раза по 5 минут.Затем на 30 минут на образцы был нанесен усилитель флуоресцентногосигнала (Image-iTFXsignalenhancer,ThermoFisherScientific),споследующей промывкой в фосфатном буфере (PBS).
На следующем этапена срезы на 30 минут был нанесен белок-блокатор (Novocastra Protein Block,Leica), для уменьшения фонового неспецифического окрашивания. Затемсрезы были инкубированы во влажной камере в течение 60 минут прикомнатной температуре с одним из перечисленных в таблице 5 первичныхантител. После чего срезы были промыты в PBS 3 раза по 5 минут, и на 60минутбылинанесенысоответствующиевторичныефлуоресцентныеантитела (таблица 5). Затем срезы были промыты в PBS 3 раза по 5 минут ипокрыты фотозащитным реагентом ProLong Gold, (страна произв. США) изаключены под покровные стекла.42Подобная методика была использована для каждого из указанныхантител,заисключениеммоноклональныхантителкdсубъединицемитохондриального комплекса V (клон 7F9BG1), которые инкубировались втечении 16 часов при температуре 4°С.
После чего был продолженвышеуказанный протокол.На первом этапе исследования проводилась отработка титров антителдля получения качественного изображения исследуемых объектов. Длякаждого из исследуемых первичных антител были использованы следующиеконцентрации: 1:100, 1:200, 1:250, 1:500, 1:1000, 1:2000. Оптимальные изних представлены в таблице 5. Для каждого из вторичных антител былииспользованы концентрации 1:1000 и 1:2000, оптимальной из которых,считаем концентрацию 1:2000.При проведении данной методики дополнительно был использованфотозащитный реагент ProLong Gold с ядерным красителем DAPI, (странапроизв.
США), что обеспечило визуализацию мышечных ядер.Для каждого образца были проведены два контрольных исследования дляисключениянеспецифическогосвязывания:впервомслучаесрезбылинкубирован с первичными неспецифическими IgG по указанной методике, послечего были использованы вторичные флуоресцентные антитела; во втором случае,была проведена инкубация только с вторичными флуоресцентными антителами. Вобоих случаях были получены отрицательные результаты.43Таблица 5. Характеристика использованных антител.Наименование первичного антителаДля общей визуализацииРазведениеНаименование вторичногоРазведениепервичногофлуоресцентноговторичногоантителаантителаантитела1:1000Антитела козы к IgG1:2000митохондрий - моноклональныемыши (Alexa Fluor 488),антитела мыши к митохондриямThermo Fisher Scientific,человека, с биотином (клон MTC02)США(по сообщению James D. McCullyэпитоп находится на наружноймитохондриальной мембране),Thermo Fisher Scientific, СШАДля визуализации митохондриального1:1000Антитела козы к IgGкомплекса IV - моноклональныемыши (Alexa Fluor 555),антитела мыши к субъединице IThermo Fisher Scientific,митохондриального комплекса IVСША1:2000(клон 1D6E1A8), InvitrogenДля визуализации митохондриального1:1000Антитела козы к IgG мышикомплекса V - моноклональные(Alexa Fluor 350),антитела мыши к d субъединицеThermo Fisher Scientific,митохондриального комплекса VСША1:2000(клон 7F9BG1), InvitrogenДля визуализации фактора HIF-1α1:100Антитела козы к IgGполиклональные антитела кролика ккролика (Alexa Fluor 555),белку HIF-1α, Thermo Fisher Scientific,Thermo Fisher Scientific,СШАСШАДля визуализации MTHSP70 –1:200Антитела козы к IgG мышимоноклональные антитела мыши (клон(Alexa Fluor 555), ThermoJG1) к митохондриальному белкуFisher Scientific, СШАтеплового шока HSP70,Thermo Fisher Scientific, США1:20001:200044На следующем этапе препараты исследовались при помощи системывизуализации EVOS (Life technologies, США) предназначенной для анализафлюоресценции и получения флуоресцентных изображений и изображенийв проходящем свете.
В полученных препаратах с помощью сравнительнойоценки яркости маркера НММ выделялись мышечные волокна I типа. Всемаркеры оценивались полуколичественным способом по бальной шкале от 0до 3:0 – отсутствие флуоресценции;1 – слабо выраженная флуоресценция;2 – умеренно выраженная флуоресценция;3 – ярко выраженная флуоресценция.Флуоресцентные изображения были получены при увеличениях Х100,Х400 и Х1000 при помощи системы EVOS. Каждый из флуоресцентныхкрасителей был зарегистрирован в соответствующем светом кубе (фильтре):регистрация флуоресцентного сигнала Alexa Fluor 488 (вторичные антителадля маркера наружной митохондриальной мембраны) осуществлялась всветовом кубе GFP (зеленый), определение сигнала Alexa Fluor 555(вторичные антитела для маркера I субъединицы IV митохондриальногокомплекса, фактора HIF-1α и белка MTHSP70) – в световом кубе RFP (красный),а сигналы от флуоресцентной метки Alexa Fluor 350 (вторичные антитела длямаркера d субъединице V митохондриального комплекса), и от флуоресцентнойядерной метки DAPI – в световом кубе DAPI (синий).
Для каждого каналафлуоресценции было установлено определенное время экспозиции, котороеподдерживалось на протяжении всего исследования. Изображения приувеличении Х100 были получены в виде файлов TIF, которые былиобработаны в программе «Видеотест - Морфология 5.2» с автоматическимопределением показателей площади, минимальной, средней, максимальнойи интегральной яркости и тона каждого из маркеров.
Был рассчитанкоэффициент отношения внутренней митохондриальной мембраны к наружной45(V/НММ), отражающий как отношение площадей маркеров, так и отношение ихяркости для оценки развитости митохондриальных крист.2.2.4. Статистическая обработка данных.Для анализа и оценки полученных данных применяли стандартныйметод описательной статистики - вычисление средних значений и ихошибок. Для анализа связи между двумя признаками применялся методранговой корреляции Спирмена и дисперсионного рангового анализа ANOVAon Ranks. Различия считались достоверными при р<0,05.
Для обработкиданных был использован язык программирования "R".46ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1.1. Характеристика иммуногистохимического распределения изучаемыхфлуоресцентных маркеров в в скелетной поперечнополосатой мышечнойткани больных с митохондриальными миопатиями.При применении маркера наружной митохондриальной мембраны (НММ) убольных с митохондриальной миопатией была обнаружена относительноравномернаяфлуоресценциямышечноговолокна,котораяможетсвидетельствовать о диффузном распределении митохондрий в этих структурах.На этом фоне, более чем в 60% мышечных волокон было обнаружено наличиеучастков более интенсивного свечения (2-3 балла), соответствующих чащесубсарколеммальным скоплениям митохондрий. У части больных наблюдалисьтакже участки более интенсивного свечения внутри мышечного волокна,соответствующие межмиофибриллярным митохондриальным скоплениям.
Онихарактеризовались меньшей выраженностью (1-2 балла) по сравнению ссубсарколеммальными скоплениями и были обнаружены не более чем в 40%мышечных волокон (Рис.3).Рис.3. Скелетная поперечнополосатая мышечная ткань пациента с митохондриальной миопатией.Возраст 7 лет. Иммуногистохимическое распределение флуоресцентного маркера наружной мембранымитохондрии (зеленый). Увеличение х400.
Определяются грубо выраженные скопления маркера НММ всубсарколеммальных (белые стрелки) и межмиофибриллярных (красная стрелка) зонах мышечныхволокон.Интересно,чточастьобнаруженныхсубсарколеммальныхмитохондриальных скоплений локализовалась в соседних мышечных волокнах47друг напротив друга, часто в эндомизии между этими волокнами наблюдалиськровеносные сосуды (феномен «оппозиции», Сухоруков, 2000).У больных с митохондриальными миопатиями наблюдалась неравномернаяфлуоресценция маркера митохондриального комплекса IV (COX), с участкамиболее интенсивного свечения маркера (2 балла), которые соответствовалираспределению маркера НММ. В отдельных зонах мышечного волокнафлуоресценция маркера COX была снижена, при этом снижения флуоресценциимаркера НММ не отмечалось.Иммуногистохимическоераспределениефлуоресцентногомаркерамитохондриального комплекса V (АТФ-синтазы) характеризовалось выраженнойнеравномерностью: так, отмечалось интенсивное свечение (2-3 балла) вмежмиофибриллярнойзонемышечноговолокна,соответствующеераспределению маркера НММ, однако при этом, в субсарколеммальных зонах, вкоторых флуоресценция маркера НММ была повышена, часто наблюдалосьпреимущественно свечение маркера митохондриального комплекса IV, призначительном снижении (до 1 балла) или полном отсутствии флуоресценциимаркера митохондриального комплекса V (Рис.4).
По всей вероятности, подобноераспределение маркера АТФ-синтазы обусловлено компенсаторным повышениемее активности в межмиофибриллярной зоне, что объясняет высокие значениясредней яркости указанного маркера (повышение яркости, т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
