Диссертация (1140070), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Тем не менее, в ряде исследованийпоказанаэффективностьиспользованияантителксубъединицаммитохондриального комплекса IV, кодируемым мтДНК, при диагностикенедостаточности СОХ [Kollberg G. et al. 2005; Mahad D. et.al., 2008; Tanji K.,Bonilla E., 2008].Так, в исследовании KollbergG.etal.(2005)описаноприменениемоноклональных антител к субъединицам I, II, III и IV СОХ на замороженныхсрезах скелетной мышечной ткани больной с G6708A мутацией мтДНК в гене,кодирующемсубъединицуСОХ,Iисклиническимисимптомамимитохондриальной миопатии и рабдомиолиза. На одном срезе мышечной тканибыло использовано одно моноклональное антитело. Гистоферментохимическоеисследование мышечной ткани больной позволил выявить значительноеснижение активности митохондриального комплекса IV в большинстве (около90%) мышечных волокон и выраженный феномен RRF.
Биохимический анализподтвердилзначительнуюизолированнуюнедостаточностьСОХ.Приприменении иммуногистохимического метода, было обнаружено выраженноеснижение количества субъединицыIСОХ в сочетании со снижением количествадругих субъединиц митохондриального комплекса IV, кодируемыемых мтДНК(субъединицы IIиIII), а также со снижением субъединицыIV,кодируемойядерной ДНК. Все этоподтверждает значимостьсубъединицы I в процессе сборкимитохондриального комплекса IV – чрезвычайно сложном процессе, требующембольшого количества факторов сборки и белковых взаимодействий, посколькуразличные субъединицы этого митохондриального комплекса вступают в процесссборки с разных сторон митохондриальной мембраны [Mick D.U.
et al. 2011].33Важно подчеркнуть, что нормальная иммунореактивность I,субъединицII,IIIиIVСОХ наблюдалась исключительно в волокнах с сохраннойактивностью этого комплекса системы OXPHOS. Это соответствует данным опрямой связи иммуногистохимической экспрессии субъединицыIСОХ сактивностью митохондриального комплекса IV [Tanji K., Bonilla E., 2008; MahadD.et.al., 2009], а также более поздним исследованиям, подтвердившимкорреляцию экспрессии и активности митохондриального комплекса IV вбольшинстве мышечных волокон [Z. Siskova. et al. 2010; Koob A.O et al. 2012;Grünewald A. et.al., 2014].В 2009 году была разработана методика иммуногистохимического анализасистемы OXPHOS в тканях больных с подозрением на митохондриальныезаболевания [DePaepeB.etal.2009a], преимущество которой состоит ввозможности использования как замороженных, так и парафиновых срезовскелетной мышечной ткани.
Особый акцент авторы этой методики делают на еепотенциал в вопросах дифференциальной диагностики мутаций ядерной имитохондриальной ДНК. При этом, как правило, нет необходимости ввизуализации каждой из субъединиц комплексов митохондриальной дыхательнойцепи, поскольку дефект одной субъединицы, чаще всего, приводит к снижениюколичества целого («собранного») комплекса.
Именно поэтому в данном методебыли использованы моноклональные антитела к одной из субъединиц каждого изпяти комплексов OXPHOS [De Paepe B. et al. 2009a].В исследовании Grünewald A. et al. (2014) сравниваются метод хромогеннойифлуоресцентнойиммуногистохимии. При примененииданныхметодовсиспользованием моноклонональных антител к митохондриальным комплексам I(субъединица 20) и IV (субъединица I) на замороженных срезах скелетноймышечной ткани были получены идентичные результаты [Grünewald A. et.al.,2014].
Однако метод хромогенной иммуногистохимии ограничен возможностьюприменения одного антитела на одном срезе, в то время как метод флуоресцентнойиммуногистохимии позволяет применять несколько антител на одном срезе, и,34следовательно, позволяет определять соотношение между различными белками наодном срезе.Таким образом, метод флуоресцентной иммуногистохимии обладает рядомпреимуществ и требует дальнейшего изучения для возможности его применения вкомплексной морфологической диагностике митохондриальных нарушений принервно-мышечных заболеваниях.35ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1.Материал исследованияИсследование было проведено на базе НИКИ Педиатрии им. акад. Ю.Е.Вельтищева РНИМУ им.Н.И. Пирогова в НИЛ общей патологии (зав. д.м.н проф.В.С. Сухоруков) на биопсийном материале скелетной поперечнополосатоймышечной ткани передней группы мышц бедра, взятом с диагностическойцелью у 93 пациентов с различными нервно-мышечными заболеваниями. Сдиагнозом митохондриальная миопатия был обследован 31 пациент в возрасте от2 до 17 лет.
Вторую группу составили 32 пациента в возрасте 1,5 года до 14 лет сдиагнозом врожденная структурная миопатия; из них: 4 пациента в возрасте от 9до 13 лет с диагнозом врожденная миопатия центрального стержня; 5 пациентов ввозрасте от 1,5 до 14 лет с диагнозом врожденная многостержневая миопатия; 6пациентов в возрасте от 2 до 5 лет с диагнозом врожденная немалиноваямиопатия; 9 пациентов в возрасте от 2 до 14 лет с диагнозом врожденнаясаркотубулярная миопатия; 8 пациентов в возрасте от 2 до 14 лет с диагнозомврожденная центральноядерная миопатия. Третью группу больных включала 30пациентов в возрасте от 1 года до 13 лет с диагнозом мышечная дистрофия; изних - 10 пациентов в возрасте от 1 года до 13 лет с диагнозом врожденнаямышечная дистрофия и 20 пациентов в возрасте от 2 до 12 лет с диагнозомпрогрессирующая мышечная дистрофия (Таблица 1).
Таким образом, общуюгруппу пациентов составили 93 пациента с указанными нервно-мышечнымизаболеваниями. Исследование проводилось с разрешения локального этическогокомитета. От всех больных (или их родителей) было получено информированноесогласие.362.2.Методы исследования.2.2.1. Клинические показатели.СтепеньтяжестизаболеванияопределяласьпошкалеFunctionalClassification Overall Progressive Childhood Muscular Dystrophy Profile According toVignos (1960) (Таблица 2).
В зависимости от степени тяжести заболевания,оцененной по этой шкале, каждому пациенту присваивались следующие баллы:1 балл соответствовал классам 1-4 по шкале Vignos - пациент может себяобслуживать, нет зависимости от помощи окружающих;2 балл – классы 5-7 по шкале Vignos - пациент может перемещаться накресле-каталке или с помощью окружающих;3 балла - классы 8 – 10 по шкале Vignos - пациент не может себяобслуживать и нуждается в постоянной помощи окружающих.Оценка мышечной силы была проведена по шкале MRS Scale, MedicalResearch Council Paralysis Scale 1976 (MRS Scale) [ВлодавецД.В,2009] (Таблица3).Утомляемость определялась по 10-балльной визуальной аналоговой шкале(ВАШ), а также при 3-х кратном проведении пробы Говерса и была разделена натри степени:1 степень –утомляемость не была обнаружена по шкале ВАШ и припроведении пробы Говерса;2 степень – выявлялась утомляемость от 1 до 6 баллов по шкале ВАШ изамедление в третьей по счету пробе Говерса.3 степень –7-10 баллов по шкале ВАШ и нарастание времени более чем на50 % в третьей пробе Говерса.37Таблица 1.
Возраст обследованных больных.Диагноз, возрастные группы1-7 лет8-12 лет13-17 лет1. Митохондриальная1310802222160061252181110100миопатия, чел (n=31)2. Врожденная миопатия,чел (n=32):Миопатия центральногостержня, чел (n=4)Многостержневая миопатия,чел (n=5)Немалиновая миопатия, чел(n=6)Сарготубулярная миопатия,чел (n=9)Центральноядернаямиопатия, чел (n=8)3. Мышечные дистрофии,чел (n=30):Врожденные мышечныедистрофии, чел (n=10)Прогрессирующие мышечныедистрофии, чел (n=20)Общее число больных (общаягруппа), чел9338Таблица 2. Оценка функционального класса активности по Vignos (1960).Пациент имеет очевидное нарушение осанки и походки, но ходит иподнимается по ступенькам без поддержки.2.
Пациент ходит, но поднимается по лестнице при помощи перил.3. Пациент ходит, но поднимается по лестнице на 8 стандартныхступеней при помощи перил более чем за 25 секунд.4. Пациент ходит, но не может подниматься по лестнице.5. Пациент ходит без поддержки, но не может поднимать ногу для шагана ступени, или не может вставать из кресла.6.
Пациент ходит только при помощи ортопедического корсета7. Пациент в кресле-каталке. Сидит прямо, может управлять креслом исовершать все жизненно необходимые действия с кресла.8. Пациент в кресле-каталке. Сидит прямо, но не может совершать всежизненно необходимые действия с кресла.9.
Пациент в кресле-каталке. Сидит прямо только при поддержке.Может совершать минимум жизненно необходимые действия скресла.10. Пациент прикован к кровати. Не может совершать жизненнонеобходимые действия без посторонней помощи.1.Таблица 3. Оценка мышечной силы конечностей по MRS Scale, 1976.0 баллов – движений нет1 балл – наличие минимальных движений2 балла – активные движения, но невозможность преодолеть силутяжести конечности3 балла – способность при выполнении определенного движенияпреодолеть силу тяжести конечности4 балла – способность при выполнении определенного движенияпреодолеть не только силу тяжести конечности, но идостаточное сопротивление исследующего5 баллов – полная сохранность двигательной функции392.2.2.
Биохимические методы исследования.Было проведено определение уровней молочной и пировиноградной кислот(ммоль/л) с помощью энзиматического метода Rollinghoff (1967) натощак и послестандартной нагрузки глюкозой из расчета 1,75 г/кг массы тела на 60 и 180минутах. На основании этих данных было рассчитано отношение лактат/пируват(коэффициент лактат/пируват) натощак и после нагрузки глюкозой.Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (Ед/л) в сывороткекровибольныхбылопроведеномодифицированнымметодомсогласнорекомендациям Скандинавского комитета по ферментам (SCE) с использованиемреагентов фирмы «HUMAN» (Германия) на анализаторе «KONELAB 20»(Финляндия) фирмы THERMO Clinical Labsystems.Определение активности креатинфосфокиназы (КФК) (Ед/л) в сывороткекрови пациента проводилось модифицированным стандартным методом согласнорекомендациямЕвропейскогоКомитетапоСтандартамвКлиническойЛаборатории (ECCLS) и Международной Федерации по Клинической Химии(IFCC) с использованием реагентов фирмы «HUMAN» (Германия) на анализаторе«KONELAB 20» (Финляндия) фирмы THERMO Clinical Labsystems.2.2.3.Морфологические методы исследования.2.2.3.1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
