Диссертация (1140070), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Использование иммуногистохимических флуоресцентных маркеров являетсяинформативным методом оценки морфофункционального состояния митохондрий вскелетной поперечнополосатой мышечной ткани при различных миопатиях.2. Характеристики иммуногистохимических маркеров митохондрий существенноотличаются при митохондриальных миопатиях от таковых при врожденныхмиопатиях и прогрессирующих мышечных дистрофиях.3. Субсарколеммальные скопления митохондрий имеют компенсаторный характер убольных врожденными миопатиями и прогрессирующими мышечными дистрофиями.4.
Применение флуоресцентных маркеров наружной митохондриальной мембраны,митохондриальных комплексов IV и V, а также регуляторных белков HIF-1α иMTHSP70 в скелетной мышечной ткани больных является важным инструментомдифференциальной диагностики нервно-мышечных заболеваний.10ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1.Строение митохондрий и организация комплексов дыхательнойцепиМитохондрии играют важную роль в большинстве клеточных процессов,среди которых апоптоз, клеточная пролиферация и дифференцировка, метаболизмаминокислот и липидов, поддержание гомеостаза кальция, и, естественно,биоэнергетическая функция, которая заключается в синтезе АТФ за счет системыокислительногомитохондриальныхфосфорилированиякомплексов(OXPHOS)(I–V),-встроенныхмитохондриальную мембрану [по обзору ChabanY.цепиферментныхвовнутреннеюet.al., 2014].
Характернойособенностью внутренней мембраны является наличие крист - обращенных вматрикс складок, что позволяет увеличить поверхность внутренней мембраны внесколько раз. В то время как наружная митохондриальная мембрана имеетпористую структуру и практически свободно пропускает ионы и небольшиенезаряженные молекулы, внутренняя митохондриальная мембрана являетсянепроницаемым барьером для всех ионов и молекул, которые могут бытьтранспортированы через нее с помощью специальных белков-переносчиков, чтосоздает электрохимический потенциал внутренней митохондриальной мембраны[по обзору Kühlbrandt W., 2015].Комплексы митохондриальной системы OXPHOS кодируются двумяразличными генетическими системами - ядерной и митохондриальной ДНК.
Вядерном геноме кодируется 76 субъединиц митохондриальной дыхательной цепи,белки сборки и многие факторы, необходимые для репликации, транскрипции итрансляциимитохондриальнойДНК(мтДНК).Всесубъединицымитохондриального комплекса II (сукцинатдегидрогеназы) кодируются ядернойДНК. В свою очередь, митохондриальная ДНК кодирует 13 субъединиц OXPHOSсистемы, которые входят в состав митохондриальных комплексов I, III, IV и V, атакже рибосомальную (рРНК) и транспортную РНК (трРНК), участвующие всинтезе митохондриальных белков (Рис.1) [по Dubowitz et.al., 2013].11Рис.1.Схематическоеизображениемитохондриальнойсистемыокислительногофосфорилирования (OXPHOS) [по Dubowitz et.al., 2013].Митохондриальная ДНК (mtDNA) кодирует 13 субъединиц системы OXPHOS, состоящей изпяти митохондриальных комплексов (I–V).
Кодируемые mtDNA субъединицы входят в составмитохондриальных комплексов I, III, IV и V. Все субъединицы митохондриального комплекса IIкодируются ядерной ДНК (nDNA). 13 полипептидов, кодируемых mtDNA, синтезируются внутримитохондрии. Необходимые для этого синтеза тРНК (tRNA) и рРНК (rRNA), также кодируются mtDNA.Ядерный геном кодирует 76 субъединиц OXPHOS системы, также белки, необходимые для ее сборки(assembly proteins). Они синтезируются в цитоплазме и импортируются в митохондрию. В ядерной ДНКкодируются белки, имеющие важное значение для репликации, транскрипции и трансляции mtDNA.MITOCHONDRION – митохондрия, NUCLEUS – ядро. [по Dubowitz et.al., 2013].Основная функция митохондриальных комплексов (I–IV) заключается всоздании протонного градиента внутренней митохондриальной мембраны за счетперемещения протонов (H+) из митохондриального матрикса в межмембранноепространство.
Преобразование протонного градиента в протон-движущую силу, воснове которой – разность pH и электрического потенциала по обе сторонывнутренней митохондриальной мембраны, используется митохондриальнымкомплексом V (АТФ-синтаза) для синтеза молекулы АТФ из АДФ инеорганического фосфата [по Campanella M. et.al., 2009].Окислительное фосфорилирование сопряжено с переносом электронов отНАДН и ФАДН2, образуемых в процессе гликолиза, окисления жирных кислот и в12цикле Кребса, по митохондриальным комплексам I–IV [по обзору Chaban Y. et.al.,2014]. Запас энергии электронов постепенно уменьшается по мере прохождениячерезцепьдыхательнойдыхательныхцепикомплексов.завершаетсяПроцессвосстановлениемпереносаэлектроновкислородаспопомощьюмитохондриального комплекса IV (Рис.2). В большинстве клеток именно с этиммитохондриальным комплексом взаимодействуют до 90% всего кислорода.Рис.
2. Схематическое изображение митохондриальной системы окислительного фосфорилирования(OXPHOS) и процесса формирование протонного градиента. [по Dubowitz et.al., 2013].Протоны (H+) из митохондриального матрикса (Matrix) перемещаются в межмембранное пространство(intermembrane space) при помощи митохондриальных комплексов I, III и IV, после чего поток (H+)вновь направляется в матрикс через митохондриальный комплекс V, что обеспечивает синтез АТФ.Красным цветом обозначены субъединицы дыхательных комплексов, кодируемых митохондриальнойДНК.1.2.Изменения митохондрий при митохондриальных миопатияхНарушения митохондриальной системы OXPHOS, включающей в себя пятьмитохондриальных комплексов, наблюдаются при целом ряде различныхзаболеваний, как в качестве их непосредственной первичной причины (примутациях митохондриальной или ядерной ДНК [Сухоруков, 2011; Greaves et.al.,2012;13Gormanet.al.,2015],такикаквторичноепроявлениедругогопатологического процесса, например воспаления (при рассеянном склерозе[Campbell et.al., 2011], миозите с тельцами включений [Oldfors et.al., 1993]), атакже дегенеративных процессов (при болезни Паркинсона [Reeve et.al., 2008]).В скелетной мышечной ткани часто наблюдаются как первичные, так ивторичные митохондриальные нарушения [Rocha et.al., 2015].
Наибольшаявыраженность патологических изменений OXPHOS, очевидно, имеет место примитохондриальных миопатиях, - гетерогенной группе прогрессирующихнервно-мышечных заболеваний, обусловленных генетическими, структурными,биохимическимидефектамимитохондрийиклиническипроявляющихсяхронической прогрессирующей наружной офтальмоплегией, рабдомиолизом,мышечной утомляемостью и выраженной слабостью проксимальных мышц[Сухоруков, 2011; Pitceathly et.al., 2014]. Для данной группы заболеванийхарактерна полисистемность, значительная вариабельность в клиническойкартине, а также, как правило, слабая корреляция между фенотипом и генотипом[Pfeffer G., Chinnery P.F., 2013].Современный алгоритм исследования и диагностики митохондриальныхзаболеваний включает в себя гистохимический и биохимический анализактивности системы OXPHOS в поврежденных тканях.
Биохимический анализпредставляет собой измерение активности каждого из компонентов OXPHOS(митохондриальные комплексы I–V) в гомогенизированной мышечной тканибольного [Rocha et.al., 2015]. Без сомнений, этот анализ информативен при оценкегрубо выраженных митохондриальных нарушений. Однако его применение непозволяетвыявитьболеетонкиедефектыOXPHOS,особенноесливпатологический процесс вовлечены лишь несколько миофибрилл.
Кроме того,проведение указанного анализа требует большого количества мышечной ткани (>50 мг), что не всегда возможно.Гистохимическое исследование сукцинатдегидрогеназы (комплекс II, СДГ)и цитохром С оксидазы (митохондриальный комплекс IV, COX) являетсястандартной методикой оценки функционирования системы OXPHOS на срезах14свежезамороженной скелетной мышечной ткани [Old et.al., 1989; Sciacco et.al.,1996; Сухоруков, 2011]. Данный метод позволяет не только определитьактивность COX и СДГ, но и обнаружить основной морфологический маркермитохондриальной патологии – феномен «рваных» красных волокон (RRF)[Сухоруков, 2011]), впервые описанный в 1963 г.
[Engel,характеризующийсявыраженнойCunningham, 1963] имитохондриальнойпролиферациейпреимущественно в субсарколеммальных зонах мышечных волокон, а также и повсему волокну. Феномен RRF часто ассоциирован с ультраструктурнымиизменениями митохондрий [Dubowitz et.al., 2013]. Важно отметить, что биопсияскелетноймышечнойтканиобычноинформативнаприподозрениинамитохондриальное заболевание, даже при отсутствии миопатического симптомокомплекса [De Paepe B. et al. 2009a].Мутации митохондриальной ДНК лежат в основе большинства заболеванийOXPHOS, генетический дефект которых установлен [MITOMAP 2012; Tuppenet.al., 2010]. Однако митохондриальные миопатии могут быть результатоммутации как ядерной, так и митохондриальной ДНК [McFarland R.
et al. 2010;SchonE.A.et.al., 2012]. Эти мутации подразделяются на несколько типов[Dubowitz et.al., 2013]:1. Точечные мутации мтДНК, являющиеся причиной наследственной атрофии зрительных нервов Лебера, синдрома MELAS (митохондриальнаяэнцефаломиопатия с лактат-ацидозом и инсультоподобными эпизодами),синдрома MERRF (миоклонус-эпилепсия с «рваными» краснымиволокнами (RRF) в скелетных мышцах), синдрома NARP (нейропатия,атаксия, пигментный ретинит) и др.2. Крупные перестройки мтДНК, вызывающие синдром Кернса-Сейра,синдром Пирсона и прогрессирующая наружная офтальмоплегия (PEO);3.
Мутации ядерных генов, приводящие к множественным делецияммтДНК или к снижению числа копий мтДНК (к заболеваниям этойгруппыотноситсямитохондриальнаяэнцефаломиопатия (MNGIE) и др.).нейрогастроинтестинальная154. Мутацииядерныхгенов,приводящиекнарушениюсинтезамитохондриальных белков (заболевания, ассоциированные с этимимутациями: комбинированная недостаточность комплексов дыхательнойцепи; синдром MLASA (миопатия, лактат-ацидоз, сидеробластнаяанемия) и др.).5. Мутации ядерных генов, приводящие к повреждению субъединицкомплексов системы OXPHOS или к нарушению белков сборки этихкомплексов (заболевания, развивающиеся вследствие этих мутаций:миопатияснепереносимостьюфизическойнагрузки;лейкоэнцефалопатия).Патогенные мутации мтДНК, как правило, являются гетероплазмическими[Payne B.A., et al.
2013], и, следовательно, «мутационная нагрузка» неравномернораспределена в скелетных мышечных волокнах [Kadenbach et.al., 2012]. Так, всоседних срезах мышечных волокон может быть обнаружено совершенноразличное количество мутантной мтДНК. Поэтому, при анализе поперечныхсрезов мышечной ткани пациентов, имеющих патогенные мутации мтДНК,выявляется мозаичность распределения ферментов OXPHOS [Rocha et.al., 2015].Случаи изолированной митохондриальной миопатии, т.е.
без поражения другихорганов и тканей, часто являются спорадическими, и мутации мтДНК могут бытьобнаружены в зрелой скелетной мышечной ткани, но не в культуре миобластов[Dubowitz et.al., 2013].Число описаний митохондриальных заболеваний, а также обнаруженныхновых мутаций увеличивается с каждым годом [Литвинова и др., 2014].Рассмотрим некоторые из них.СиндромMERRF(миоклонус-эпилепсияс«рваными»краснымиволокнами (RRF) в скелетных мышцах), в основе которого лежат точечныемутации мтДНК в генах, кодирующих транспортную РНК лизина.
Около 80%пациентов с синдромом MERRF имеют мутацию A8344G, а приблизительно 10%пациентов имеют одну из мутаций T8356C, G8361A и G8363A [Brackmann F. et al.2012; Lorenzoni P. J. et.al., 2014]. Эти мутации нарушают процесс трансляции РНКна16митохондриальныхрибосомах.МутациимтДНКдосихпорнеидентифицированы у 10% пациентов с синдромом MERRF [Lorenzoni P. J. et.al.,2014].Клинические симптомы этого заболевания сильно варьируют средипациентов [El-HattabA.W.,ScagliaF.,2015]. Некоторые их симптомов могутотсутствовать на ранних стадиях заболевания, но при его прогрессировании,клиническая манифестация, как правило, унифицируется [DiMauro S., et al.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
