Диссертация (1140070)
Текст из файла
Министерство здравоохранения Российской ФедерацииФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯРОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙМЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТИМЕНИ Н.И. ПИРОГОВАНа правах рукописиБаранич Татьяна ИвановнаИммуногистохимическийанализморфофункциональногосостояниямитохондрий в скелетной поперечнополосатой мышечной ткани примиопатиях различного генеза у детей.03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология14.03.02 - патологическая анатомиядиссертация на соискание учёной степеникандидата медицинских наукНаучные руководители:доктор медицинских наук, профессор В.В.
Глинкинадоктор медицинских наук, профессор В.С. СухоруковМосква – 20162ОГЛАВЛЕНИЕСписок сокращений4Введение6ГЛАВА 1. Обзор литературы1.1. Строение митохондрий и организация комплексов дыхательной цепи.101.2. Изменения митохондрий при митохондриальных миопатиях.121.3. Изменения митохондрий при врожденных структурных миопатиях.191.4.
Изменения митохондрий при врожденных и прогрессирующих мышечныхдистрофиях.1.5. Роль MTHSP70 и HIF-1α в патогенезе митохондриальных нарушений.22271.6.Возможность использования иммуногистохимического метода в диагностикенервно-мышечных заболеваний.32ГЛАВА 2. Материалы и методы2.1. Материал исследования352.2. Методы исследования352.2.1. Клинические показатели352.2.2. Биохимические методы исследования392.2.3.Морфологические методы исследования392.2.3.1. Гистоферментохимический метод392.2.3.2.
Метод флуоресцентной иммуногистохимии412.2.4. Статистическая обработка данных45ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение463.1.1. Характеристика иммуногистохимического распределения изучаемых флуоресцентныхмаркеров в скелетной поперечнополосатой мышечной ткани больных смитохондриальными миопатиями463.1.2. Обсуждение данных корреляционного анализа исследованных флуоресцентныхиммуногистохимических маркеров в группе больных с митохондриальнымимиопатиями.563.2.1. Характеристика иммуногистохимического распределения изучаемых флуоресцентныхмаркеров в в скелетной поперечнополосатой мышечной ткани больных с врожденнымиструктурными миопатиями.3.2.1.1.Миопатия центрального стержня727233.2.1.2.
Многостержневая миопатия813.2.1.3. Немалиновая миопатия863.2.1.4. Саркотубулярная миопатия913.2.1.5. Центральноядерная миопатия973.2.2. Обсуждение данных корреляционного анализа исследованных флуоресцентныхиммуногистохимических маркеров в группе больных с врожденными структурнымимиопатиями1013.3.1. Характеристика иммуногистохимического распределения изучаемых флуоресцентныхмаркеров в скелетной поперечнополосатой мышечной ткани больных с мышечнымидистрофиями1173.3.2.
Обсуждение данных корреляционного анализа исследованных флуоресцентныхиммуногистохимических маркеров в группе больных с мышечными дистрофиями 1253.4. Обсуждение данных корреляционного анализа исследованных флуоресцентныхиммуногистохимических маркеров в общей группе больных142Заключение153Выводы166Практические рекомендации169Список литературы1704СПИСОК СОКРАЩЕНИЙАДФ - аденозиндифосфатАТФ - аденозинтрифосфатВМД - врожденные мышечные дистрофииВСМ – врожденные структурные миопатииДНК - дезоксирибонуклеиновая кислотакоэф. корр – коэффициент корреляцииКФК - креатинфосфокиназаЛДГ - лактатдегидрогеназамтДНК – митохондриальная дезоксирибонуклеиновая кислотаНММ – наружная мембрана митохондрийПМД - прогрессирующие мышечные дистрофииСДГ - сукцинатдегидрогеназаCOX – цитохром С оксидазаCox1 - субъединица 1 митохондриального комплекса IVCox4 - субъединица 4 митохондриального комплекса IVCox5а - субъединица 5а митохондриального комплекса IVHIF-1α - фактор, индуцируемый гипоксиейKSS - Cиндром Кернса-СейраLGMD - конечностно-поясные мышечные дистрофииLGMD1H - конечностно-поясная мышечная дистрофия типа 1HLGMD2A - конечностно-поясная мышечная дистрофия типа 2А (кальпаинопатия)MELAS - синдром; митохондриальная энцефаломиопатия с лактат-ацидозом иинсультоподобными эпизодамиMERRF - синдром; миоклонус-эпилепсия с «рваными» красными волокнами вскелетных мышцахMLASA - синдром; миопатия, лактат-ацидоз, сидеробластная анемия.MNGIE - митохондриальная нейрогастроинтестинальная энцефаломиопатияMTHSP70 - митохондриальный белок теплового шока 70MTM1 - миотубуларин 15NARP – синдром; нейропатия, атаксия, пигментный ретинитOXPHOS – митохондриальная система окислительного фосфорилированияPEO - прогрессирующая наружная офтальмоплегияRRF - «рваные» красные волокнаRYR1 - рианодиновый рецепторTIM - транслоказа внутренней митохондриальной мембраныTOM - транслоказа внешней митохондриальной мембраныV/НММ – коэффициент «митохондриальный комплекс V/ наружная мембранамитохондрий»VEGF - фактор роста эндотелия сосудов6ВВЕДЕНИЕАктуальность темыСвоевременная диагностика, а также прогнозирование характера течениямитохондриальныхнарушенийимеетогромноезначение,позволяющееклиницистам подобрать адекватную терапию и обеспечить оптимальный уход запациентом.
Однако, в настоящий момент фундаментальное представление офакторах,лежащихвосновеиопределяющихпрогрессированиемитохондриальных миопатий, а также митохондриальных нарушений при другихнервно-мышечных заболеваниях, сильно ограничено, а исследования частопротиворечивы в своих выводах.В настоящее время появляется все больше данных о митохондриальныхизменениях при целом ряде нервно-мышечных заболеваний, при этом подобныеизменения могут быть связаны с непосредственной причиной заболевания (как вслучаях митохондриальных миопатий) [Greaves et.al., 2012; Gorman et.al., 2015],так и быть вторичным проявлением другого патологического процесса [Campbellet.al., 2011].
Одним из наиболее частых проявлений митохондриальныхизменений является количественное изменение пула митохондрий и появлениеаномальных скоплений этих органелл, главным образом, в периферических(субсарколеммальных) и, в меньшей степени, в межмиофибриллярных зонахмышечных волокон [Stadhouders, Sengers, 1987; Ferreira et.al., 2010; Сухоруков,2011]. Данные изменения имеют место при митохондриальных миопатиях, атакже описываются у части больных с некоторыми формами врожденныхмиопатий и прогрессирующих мышечных дистрофий.
Тем не менее, механизмы,лежащие в основе формирования и регуляции подобных скоплений в мышечнойткани пациентов до сих пор остаются неизвестными.Диагностикамитохондриальнойдисфункциивызываетзначительныезатруднения в связи с многообразием проявлений митохондриальных нарушений,мозаичности их распределения в тканях организма и сложности их методическоговыявления. Основными методами диагностики митохондриальных измененийявляются биохимический и гистоферментохимический методы определения7активности митохондриальных ферментов в мышечной ткани больных, а такжеметод электронной микроскопии.
На сегодняшний день иммуногистохимическийметод исследования митохондриальных белков мало используется в диагностикенервно-мышечных заболеваний. Тем не менее, методика иммуногистохимиипозволяет обнаружить специфические белки в различных тканях и может бытьметодом изучения генов как мтДНК, так ядерной ДНК, что особенно важно примитохондриальныхзаболеваниях,имеющихдвойноегенетическоепроисхождение.Таким образом, использование флуоресцентной иммуногистохимии вдиагностике митохондриальных изменений при различных нервно-мышечныхзаболеваниях представляется крайне перспективным, и имеет ряд преимуществ посравнению с методомхромогеннойиммуногистохимии, поскольку применениефлуоресцентных антител не только обеспечивает прямую визуализацию сайтовсвязывания антител и антигенов, но также позволяетприменятьнесколькоантител на одном срезе мышечной ткани, и следовательно, определятьпространственное и количественное соотношение между различными белками наодном препарате.Цель исследования: выявить параметры морфофункционального состояниямитохондрий в скелетной поперечнополосатой мышечной ткани при различныхнаследственных нервно-мышечных заболеваниях с помощью флуоресцентногоиммуногистохимического исследования и оценить информативность метода вкомплексной морфологической диагностике.Задачи исследования:1.
Разработатьметодическийподходкиммуногистохимическомуопределению морфофункционального состояния митохондрий в скелетнойпоперечнополосатой мышечной ткани при миопатиях.2. Выявить особенности распределения выбранных иммуногистохимическихмаркеров: наружной митохондриальной мембраны и митохондриальных8комплексов IV и V, а также маркеров фактора, индуцируемого гипоксией 1α(HIF-1α) и митохондриального белка теплового шока 70 (MTHSP70) примитохондриальных и врожденных миопатиях, а также прогрессирующихмышечных дистрофиях.3.
Провести сравнительную морфометрическую оценку количественныхпараметров флуоресценции выбранных маркеров в мышечных волокнах втрех изученных группах больных.4. Определить информационную значимость исследованных показателей наоснованиисопоставленияиммуногистохимическогополученныханализасданнымирезультатовклиническогоибиохимического обследования больных исследованных групп.5.
Определитьтактикувыбораипоследовательностьвыявленияиммуногистохимических флуоресцентных маркеров в дифференциальнойморфологической диагностике изученных нервно-мышечных заболеваний.Научная новизна:Разработан методический подход, позволяющий провести комплекснуюоценку состояния тканевой энергетики с помощью иммуногистохимическогоопределения флуоресцентных маркеров (маркера наружной митохондриальноймембраны, митохондриальных комплексов IV и V, HIF-1α и MTHSP70) вскелетной поперечнополосатой мышечной ткани при митохондриальных иврожденных миопатиях, а также при прогрессирующих мышечных дистрофиях.Установлены отличия иммуногистохимических характеристик митохондрий примитохондриальных миопатиях от таковых при врожденных миопатиях ипрогрессирующих мышечных дистрофиях.
На основании корреляций с клиникобиохимическими показателями обосновано представление об адаптационномхарактере субсарколеммальных скоплений митохондрий при врожденныхмиопатиях и прогрессирующих мышечных дистрофиях. Впервые оцененораспределение флуоресцентных иммуногистохимических маркеров HIF-1α иMTHSP70 в мышечной ткани исследованных больных. Выявлен феномен9«колокализации» HIF-1α и митохондриальных скоплений. Впервые выявлено, чтопри патологических изменениях мышечной ткани различной природы в единичнорасположенных митохондриях имеет место активация белка MTHSP70.Практическая значимость: определены оптимальные титры и времяинкубации каждого из исследованных первичных антител (маркера наружноймитохондриальной мембраны, митохондриальных комплексов IV и V, HIF-1α иMTHSP70)дляполученияиммуногистохимическихпрепаратовскелетнойпоперечнополосатой мышечной ткани пациентов с различными миопатиями;разработаналгоритмфлуоресцентнойокраскитремямитохондриальнымимаркерами и двумя маркерами регуляторных белков, позволяющий оценитьсостояние процессов тканевой энергетики в мышечной ткани пациентов сразличнымимиопатиями.флуоресцентногомышечныхПодтвержденаиммуногистохимическогозаболеваний.Предложеныинформативностьметодависпользованиядиагностикеиммуногистохимическиенервнокритериидифференциальной диагностики митохондриальной и врожденных миопатий, атакже прогрессирующих мышечных дистрофий.Положения, выносимые на защиту.1.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
