Диссертация (1140057), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Измерение ХЛ проводили на хе-59 милюминометре Lum-1200 (ООО «ДиСофт», Россия) с программным обеспечением PowerGraph 3,3 Professional. Реакционная среда имела следующий состав: 10 мкМ люминола (чда, «Вектон», Россия), 1 мМ ЭДТА (≥99%, SigmaAldrich, США) и 1 мМ АБАП (Aldrich, США) в 50 мМ Трис-HCl буфере, содержащем 0,14 М хлорида натрия, pH 8,0. В качестве стандартного антиоксиданта использовали тролокс. АОА печени крыс выражали в виде «тролоксового эквивалента» – в микромолях тролокса (Sigma, США) на 1 г сырой ткани.2.8.
Методы исследования гиполипидемической активностилиофилизированного водного извлечения караганы гривастойна модели экспериментальной гиперлипидемииИсследования гиполипидемической активности лиофилизированноговодного извлечения караганы гривастой проведены с использованием моделиэкспериментальной гиперлипидемии, вызванной масляным раствором Твин80 (Panreac, США), согласно «Руководству по проведению доклиническихисследований лекарственных средств» (2012 г.).Эксперименты осуществляли на 30 аутбредных белых крысах-самцахWistar массой 280–320 г. После завершения 14-дневного карантина все животные были случайным образом разделены на группы (табл. 9).Таблица 9Группы исследуемых животных№группы123НазваниегруппыИнтактнаяn=10Контрольнаяn=10Опытнаяn=10Описание группыУ крыс не вызывали гиперлипидемию и не вводили исследуемые препаратыКрысам с гиперлипидемией внутрижелудочно вводилидистиллированную водуКрысам с гиперлипидемией внутрижелудочно вводиливодный раствор ЛВИК60 За 10 суток до индукции гиперлипидемии животным опытной группывнутрижелудочно вводили раствор ЛВИК в дозе 308 мг/кг в пересчете на сухой остаток и в объеме 1,5 мл, животные контрольной группы получали эквиобъемные порции дистиллированной воды.
Гиперлипидемию вызываливнутрибрюшинным введением Твин-80. С этой целью животных на 12 ч лишали доступа к корму. После пищевой депривации крысам внутрибрюшинновводили 1,25 мл/кг Твин-80, нагретого до 35 °С. На следующие сутки образцы крови крыс отбирались из хвостовой вены в объеме 250 мкл. Кровь центрифугировали при 2800 об/мин в течение 10 мин и отбирали плазму.
Значения биохимических показателей (общего холестерола и триацилглицеридов)в плазме крови определяли с использованием наборов фирмы Intermedica(США) на биохимическом анализаторе фирмы Biochem (США).61 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯХИМИЧЕСКОГО СОСТАВАИ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИКАРАГАНЫ ГРИВАСТОЙ IN VITRO3.1. Результаты исследования флавоноидовв лиофилизированном водном извлечении караганы гривастойметодом ВЭЖХ с диодно-матричными масс-спектрометрическим детектированиемС помощью ВЭЖХ-ДМД-МС нами впервые был получен профиль флавоноидов караганы гривастой.
Результаты исследования содержания и состава флавоноидов в образцах водных извлечений караганы гривастой (сборы2010 и 2015 гг.) представлены в табл. 11.ВЭЖХ-ДМД-МС-анализ показал, что в водных извлечениях караганыгривастой содержатся преимущественно моно- и дигликозиды, являющиесяпроизводными О-гидроксилированных флавонолов (мирицетина, кверцетина,кемпферола) и О-метилированных флавонолов (изорамнетина, ларицитринаи сирингетина). Структуры вышеперечисленных флавонолов представлены втабл. 10. Хроматограммы водных извлечений караганы сборов 2010 и2015 гг. изображены на рис.
2–7. Спектр поглощения флавона № 31 показанна рис. 8.62 Таблица 10Структуры основных флавонолов, гликозиды которых обнаружены вкарагане гривастойНазваниеR1R2КемпферолННКверцетинОННИзорамнетинОСН3НМирицетинОНОНЛарицитринОСН3ОНСирингетинОСН3ОСН3В качестве основных флавоноидов в водных извлечениях караганыгривастой (сборы 2010 и 2015 гг.) были идентифицированы кверцитрин(4,87–6,03 мг/г), гиперозид (2,73–3,73 мг/г), мирицетин-3-рамнозид (2,01–2,04мг/г), авикулярин (1,72–2,39 мг/г), ларицитрин-3-рамнозид (1,71–1,79 мг/г),3-рамнозиды изорамнетина и сирингетина (1,76–1,77 мг/г). Как видно изтабл.
3, для караганы гривастой характерно наличие 3-рамнозидов, пентозидов (в том числе 3-арабиноидов и 3-ксилозидов) и софорозидов/3,5диглюкозидов вышеперечисленных флавонолов. В исследованных экстрактах также присутствовало незначительное количество производных флавонов – дигликозид апигенина и гликозиды диметилированного флавона.
Суммарное содержание флавоноидов караганы гривастой в сборе 2010 г. составило 27,15 мг/г, в сборе 2015 г. – 31,27 мг/г.Метрологическая характеристика результатов исследования профиляфлавоноидов в водных извлечениях караганы гривастой на примере основных флавоноидов караганы гривастой (сбор 2015 г.) представлены в табл. 12.63 Рисунок 2. Хроматограмма водного извлечения караганы (сбор 2010 г.)при λ=339 нмРисунок 3. Хроматограмма водного извлечения караганы (сбор 2010 г.)при λ=350 нм64 Рисунок 4. Хроматограмма водного извлечения караганы (сбор 2010 г.)при λ=365 нмРисунок 5.
Хроматограмма водного извлечения караганы (сбор 2015 г.)при λ=339 нм65 Рисунок 6. Хроматограмма водного извлечения караганы (сбор 2015 г.)при λ=350 нмРисунок 7. Хроматограмма водного извлечения караганы (сбор 2015 г.)при λ=365 нм66 x10 2 UV (23.551-23.871 min) Caragana jubata_2015.d Subtract1.61.41.210.80.60.40.20210220230240250260270280290 300 310 320mAU vs.
Wavlength (nm)330340350360370380390Рисунок 8. УФ-спектр глюкозида неидентифицированного флавона № 3167 Таблица 11Результаты ВЭЖХ-ДМД-МС флавоноидов в водных извлечениях караганы (сборы 2010 и 2015 гг.)№Флавоноидk*1.Кверцетин-3-софорозид иликверцетин-3,5-диглюкозид1,822.Мирицетин-3-галактозид2,053.Мирицетин-3-глюкозид2,094.Кемпферол-3-софорозид иликемпферол-3,5-диглюкозид2,155.Изорамнетин-3-софорозид илиизорамнетин-3,5-диглюкозид2,226.Мирицетин-пентозид2,237.Кверцетин-3-самбубиозид2,278.Рутин2,33m/z627.15465.10303.05481.10319.05481.10319.05611.16449.11287.06641.17479.12317.07451.09319.05597.15465.10303.05611.15465.10303.05Детектируемый ионλmax, нм[M+H]+[M – глюкоза** +Н]+[М – 2 глюкозы +Н]+[M+H]+[M – галактоза +Н]+[M+H]+[M – глюкоза +Н]+[M+H]+[M – глюкоза +Н]+[M – 2 глюкозы +Н]+[M+H]+[M – глюкоза +Н]+[M – 2 глюкозы +Н]+[M+H]+[M – пентоза +Н]+[M+H]+[M – глюкоза +Н]+[M – самбубиоза +Н]+[M+H]+[M – глюкоза +Н]+[M – рутиноза +Н]+256, 268,356Содержание, мг/гСбор 2010 Сбор 2015г.г.1,461,72254, 268,362254, 268,362268, 3480,490,480,220,230,330,35254, 268,3580,650,59254, 268,362256, 266,3540,310,310,410,430,370,49256, 266,35268 №9.ФлавоноидМирицетин-3-арабинозид10.
Мирицетин-3-ксилозидk*2,392,4511. Мирицетин-3-рамнозид (мирицитрин) 2,4912. Гиперозид2,5313. Изокверцитрин2,5714. Кверцетин-3-арабинозид(авикуля- 2,78рин)15. Кемпферол-3-глюкозид (астрагалин)2,8716. Ларицитрин-пентозид17. Кверцетин-пентозид2,9418. Изорамнетин-3-глюкозид2,9819. Кверцитрин3,03 m/z451.09319.05451.09319.05465.10319.05465.10303.05465.10303.05435.09303.05449.11287.06435.10303.05435.10303.05479.12317.07449.11303.05Детектируемый ион[M+H]+[M – арабиноза +Н]+[M+H]+[M – ксилоза +Н]+[M+H]+[M – рамноза +Н]+[M+H]+[M – галактоза +Н]+[M+H]+[M – глюкоза +Н]+[M+H]+[M – арабиноза +Н]+[M+H]+[M – глюкоза +Н]+[M+H]+[M – пентоза +Н]+[M+H]+[M – пентоза +Н]+[M+H]+[M – глюкоза +Н]+[M+H]+[M – рамноза +Н]+λmax, нм254, 268,364254, 268,364254, 268,362256, 266,354256, 266,354256, 266,356268, 348256, 266,352256, 266,352256, 266,348256, 266,350Содержание, мг/гСбор 2010 Сбор 2015г.г.0,290,290,230,302,042,012,733,730,560,561,722,391,481,710,651,111,231,104,876,0369 №Флавоноидk*20.
Ларицитрин-3-рамнозид3,0621. Кемпферол-пентозид3,2622. Апигенин + гексоза + пентоза23. Изорамнетин-3-малонилглюкозид3,3124. Изорамнетин-пентозид3,3525. Сирингетин-пентозид26. Изорамнетин-пентозид3,4027. Кемпферол-3-рамнозид3,5128. Изорамнетин-пентозид29. Изорамнетин-3-рамнозид30. Сирингетин-3-рамнозид3,56m/z479.12333.06419.11287.06565.12271.07565.12317.07449.11317.07479.12347.08449.11317.07433.12287.07449.11317.07463.13317.07493.13347.08Детектируемый ион[M+H]+[M – рамноза +Н]+[M+H]+[M – пентоза +Н]+[M+H]+[M – пентоза +Н]+[M+H]+[M – малонилглюкоза+Н]+[M+H]+[M – пентоза +Н]+[M+H]+[M – пентоза +Н]+[M+H]+[M – пентоза +Н]+[M+H]+[M – рамноза +Н]+[M+H]+[M – пентоза +Н]+[M+H]+[M – рамноза +Н]+[M+H]+[M – рамноза +Н]+λmax, нм256, 266,350266, 359Содержание, мг/гСбор 2010 Сбор 2015г.г.1,711,790,560,65254, 266,3620,300,38256, 266,3620,630,62256, 266,370268,348254, 266,350256, 266,3480,500,640,660,731,761,77266, 34070 №Флавоноидk*m/z31.
Флавон-(1 гидрокси + 2 метокси- 3,82группы)-глюкозид32. Флавон-(1 гидрокси + 2 метокси- 4,24группы)-малонилглюкозид461.15299.09547.15299.0933. Кверцетин4,43303.0534. Неидентифицированные флавоноиды4,75341.13357.13299.09Детектируемый ионλmax, нм[M+H]+260, 320[M – глюкоза +Н]+[M+H]+260, 320[M – малонилглюкоза+Н]+[M+H]+256, 266,374[M+H]+230, 284,[M+H]+348[M+H]+258, 32035.
Флавон-(1 гидрокси- + 2 метокси- 6,11группы)Суммарное содержание флавоноидовСодержание, мг/гСбор 2010 Сбор 2015г.г.0,190,240,310,290,260,100,150,160,080,0727,1531,27Согласно определенным метрологическим характеристикам методики анализа флавоноидов, относительная систематическая погрешность измерений для всех флавоноидов не превышала 8,2%.* Фактор удерживания (коэффициент емкости).** Остаток моно- или дисахарида: молекулярная масса минус 18 а.е.м. (молекула воды, теряющаяся при образованиигликозидной связи).71 Таблица 12Метрологическая характеристика результатов определенияосновных флавоноидов в водном извлечении караганы гривастой(сбор 2015 г.) методом ВЭЖХ-ДМД-МС (P = 95 %; n = 4)ФлавоноидКверцетин-3софорозид иликверцетин-3,5диглюкозидМирицетин-3рамнозид (мирицитрин)ГиперозидКверцетин-3арабинозид (авикулярин)КверцитринЛарицитрин-3рамнозидxср,SSxcp t(P,t) ∆xS2мг/г3 1,72 0,0015 0,0392 0,0196 3,18 0,120,06εср,%3,623 2,010,0010 0,0316 0,0158 3,180,100,052,503 3,733 2,390,0019 0,0432 0,0216 3,180,0013 0,0356 0,0178 3,180,140,110,070,061,842,373 6,033 1,790,0030 0,0548 0,0274 3,180,0030 0,0548 0,0274 3,180,170,090,090,041,442,43f∆xcp3.2.
Результаты исследования антиоксидантной активностилиофилизированного водного извлечения караганы гривастойметодом активированной хемилюминесценции АБАП in vitroНа рис. 9 показана типичная кинетика хемилюминесценции системыАБАП-люминол при добавлении к ней исследуемых образцов из изучаемыхрастений. На рисунке видно, что введение образцов в модельную системуприводило к ингибированию свечения и появлению латентного периода (τ).Появление латентного периода ХЛ связано с тем, что антиоксиданты, входящие в состав растительного сырья, перехватывают пероксильные радикалы,образующиеся при термическом разложении АБАП, что вызывает торможение окисления люминола.
Как только все антиоксиданты инактивируются,72 латентный период заканчивается, и процесс окисления люминола продолжается.Рисунок 9. Типичная кинетика ХЛ системы АБАП-люминолв присутствии исследуемых образцов водного извлечения1, 4 – открытие и закрытие шторки хемилюминометра соответственно;2 – введение АБАП; 3 – введение исследуемого образца;τ – латентный период.Обнаружено, что латентный период ХЛ системы АБАП-люминол увеличивался прямо пропорционально концентрации исследуемых образцов.Аналогичная зависимость была получена и для тролокса, который являетсяводорастворимым структурным аналогом витамина Е и обычно применяетсяв качестве стандартного антиоксиданта при проведении подобных исследований.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
