Диссертация (1139975), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Методика определения метаболической активности изоферментаCYP3A4 методом высокоэффективной жидкостной хроматографииМатериал для исследования: 5 мл утренней мочи, собранные на 3-5 день впробирки без консерванта и замороженной при температуре минус 20 градусов поЦельсию. Содержание 6-бета-гидроксикортизола (6-OHC) и кортизола (FC)определялосьметодомхромато-масс-спектрометрическогоанализанавысокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent G1978B Multimode Soursefor 6410 Triple Quade LC/MS (Agilent Technologies, Inc., USA). Метаболическаяактивность CYP3А4 оценивалась по отношению 6-бета-гидроксикортизол/кортизолв утренней моче.
Метод разработан и валидизирован Смирновым В.В., 2010 г.72ПроведениекомпаниямсданногоцельюисследованияоценкиролирекомендованоизоферментовфармацевтическимцитохромаР-450вбиотрансформации ЛС (Сычев ДА, 2009). Метод основан на образованииметаболита эндогенного кортизола под влиянием изофермента CYP3А4 (Рисунок11).Более высокие значения 6-бета-гидроксикортизол/кортизол свидетельствуюто высокой активности изофермента CYP3А4, и меньшие о низкой (Смирнов ВВ,2010).
Для экстракции данных стероидов из мочи использовался метод жидкожидкостной экстракции. Экстрагент - смесь этилацетат/изопропанол (85/15).73Рисунок 11 - Метаболизм эндогенного кортизола (Источник: Отделенов ВА, 2015)Техника проведения. Экстракцию проводилась дважды из 2 мл мочичетырьмя миллилитрами экстрагента. После центрифугирования в течение 5 минутпри скорости 3000 об/мин, отделялись и объединялись органические слои. Дляулучшения экстракции к объединенному органическому слою добавляли 2 мл 1Нраствора NaOH, пробу помещали на шейкер, и потом центрифугировали 5 минут74при скорости 3000об/мин. Объединенный органический слой упаривали навакуумно-выпарительном аппарате.Дляпостроенияприготовленыпробыкалибровочногопутемдобавленияграфика(ПриложениерастворовкортизолаБ)ибыли6-бета-гидроксикортизола известных концентраций к моче здоровых добровольцев.Определение кортизола и 6-бета-гидроксикортизола в моче проводилось наприборе Agilent G1978B Multimode Sourse for 6410 Triple Quade LC/MS (AgilentTechnologies, Inc., USA).
Объем вкола составлял 10 мкл. Состав подвижной фазы:55% воды, подкисленной НСООН (1мл муравьиной кислоты на 1 литр воды) и 45%ацетонитрила. Скорость потока подвижной фазы – 0,5 мл/минуту. Колонка:обращеннофазная Waters (5мкм; 4,6×150мм), температура колонки – 350 С. Длиннаволны ультрафиолетового детектора составила 246 нм. Масс-детектор работал врежиме сканирования в позитивной полярности. Тип ионизации: MM-ES + APCI.2.6. Статистическая обработка результатовСтатистическая обработка результатов проводилась в SPSS Statistics 20.0.Средние показатели представлены как М±SD, где М — среднее, SD — стандартноеотклонение.
Проверка нормальности распределения проводилась с помощьюкритерияКолмогорова-Смирнова.Дляоценкидостоверностиразличийколичественных показателей был применен однофакторный дисперсионный анализ- ANOVA, в случае ненормального распределения критерий Манна-Уитни илиКрускала-Уолиса. Определение влияния количественных факторов на активностьтромбоцитов проводилась при помощи линейного регрессионного анализа. Дляустановления различий категориальных показателей был применен критерий хиквадрат Пирсона χ2. Влияния генов CYP2C19 и ABCB1 на агрегацию тромбоцитовоценивалось методом логистической регрессии; в число ковариат были так жевключены переменные, имеющие тенденцию к значимости различий между75группами агрегации в вариационном анализе (нарушение ритма, прием блокаторовмедленных кальциевых каналов).
Для проверки соблюдения равновесия Харди–Вайнберга применялся точный критерий Фишера. Различия считались значимымипри р<0,05.76ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ3.1. Оценка ассоциации носительства генотипов по CYP2C19 и ABCB1 состаточной реактивностью тромбоцитов на фоне применения клопидогрела упациентов острым коронарным синдромом, перенесших чрескожныекоронарные вмешательстваРаспределение генотипов CYP2C19 среди больных ОКС: 68 (84,0%)пациентов имели нормальный генотип (CYP2C19*1/*1) и 13 (16,0%) являлисьносителями аллеля связанного со сниженным метаболизмом (CYP2C19*1/*2).Частота носительства аллельного варианта CYP2C19*2 составляет – 8 %.
ГенотипCYP2C19*2/*2 и аллельный вариант CYP2C19*3 не обнаружены. Распределениеаллелей и генотипов соответствовало закону Харди–Вайнберга (χ2=0,61; p=0,43).Носительство CYP2C19*2 достоверно чаще встречалось в группе резистентных кклопидогрелу (PRU>208): 36,8% против 9,7% (р=0,01), (Таблица 14).
Среднийпроцент ингибирования тромбоцитов был так же значительно выше у пациентовбез CYP2C19*2 по сравнению с носителями данного аллеля: 30,7±20,1 в группеCYP2C19*1/*1 против 18,2±16,4 в группе CYP2C19*1/*2 (р=0,03).Доля пациентов с лабораторной резистентностью к клопидогрелу (PRU>208)оказалась выше среди носителей CYP2C19*2, по сравнению с пациентами безданного аллеля (Таблица 14): 53,8% среди пациентов с генотипом CYP2C19*1/*2 и16,2% с генотипом CYP2C19*1/*1 (ОШ=1,8; 95% ДИ: 1,0–3,2; р=0,0067), (Рисунок12).77Таблица 14 - Таблица сопряженности (хи-квадрат Пирсона χ2) для генотиповCYP2C19 и активности тромбоцитов (р=0,01)ГруппаИтогоCYP2C19*1/*1*1/*2PRU < 208N5666290,3%9,7%100,0%82,4%46,2%76,5%PRU > 208% генотипов вгруппе PRU < 208% PRU < 208 вгенотипах CYP2C19N1271963,2%36,8%100,0%16,2%53,8%23,5%Итого% генотипов вгруппе PRU > 208% PRU > 208 вгенотипах CYP2C19N681381% генотипов84,0%16,0%100,0%Рисунок 12 - Частота носительства аллельного варианта CYP2C19*2 средипациентов с нормальной и повышенной агрегацией (р=0,01).Распространенность генотипов СС, СТ и ТТ гена ABCB1 составила: 17(21,0%), 51 (63,0%) и 13 (16,0%), соответственно.
Частота носительстваносительство аллельного варианта Т гена АВСВ1, ассоциированного с нарушением78абсорбции клопидогрела и его антиагрегантного действия, составляет 47,5%.Распределение аллелей и генотипов не соответствовало закону Харди–Вайнберга(χ2=5,5; p=0,01), что связано с особенностями распространенности гетерозиготныхформ носительства гена ABCB1. При этом для оценки роли носительствааллельного варианта Т принято объединять носителей генотипа СС + СТ противносителей генотипа ТТ (Рисунок 13).
Статистически значимой ассоциации междуносительством аллельного варианта Т гена ABCB1 и активностью тромбоцитов необнаружено (Таблица 15).Таблица 15 - Таблица сопряженности (точный критерий Фишера F) для генотиповABCB1 и активности тромбоцитов (р=0,75).ГруппаИтогоABCB1CCCTTTPRU < 208N1338116221,0%61,3%17,7%100,0%76,5%74,5%84,6%76,5%PRU > 208% генотипов вгруппе PRU < 208% PRU < 208 вгенотипах ABCB1N41321921,1%68,4%10,5%100,0%23,5%25,5%15,4%23,5%Итого% генотипов вгруппе PRU > 208% PRU > 208 вгенотипах ABCB1N17511381% генотипов21,0%63,0%16,0%100,0%79Рисунок 13 - Частота носительства генотипов СС, СТ и ТТ гена ABCB1 средипациентов с нормальной и повышенной агрегацией (р > 0,05).Приисследованииразличийвколичественныхпеременныхмеждуносителями нормального генотипа CYP2C19*1/*1 (экстенсивные метаболизаторы)и генотипа CYP2C19*1/*2 (промежуточные метаболизаторы) с применениемкритерия Манна-Уитни, значимые различия получены только по среднему уровнюЛПНП (2,8±1,2 против 3,5±0,9; р=0,005), триглицеридов (1,6±0,6 против 2,1±0,8;р=0,019) и проценту ингибирования тромбоцитов (30,6±20,0 против 18,2±16,4;р=0,013), (Таблица 16).Таблица 16 - Оценка различий между генотипами CYP2C19 с помощью критерияМанна-Уитни для переменных с ненормальным распределением.ПоказателиИтогоCYP2C19p*1/*1*1/*2МσМσМσ12345678Лейкоциты9,02,68,72,29,02,5р > 0,05Тромбоциты231,556,4200,195,9226,464,6р > 0,058012345678Гемоглобин141,718,0144,515,0142,117,5р > 0,05Общийхолестерин5,11,25,41,15,21,2р > 0,05ЛПНП2,81,23,50,92,91,20,005Триглицериды1,60,62,10,81,70,70,019Креатинин105,421,5103,713,6105,120,4р > 0,05Глюкоза6,76,17,12,86,85,7р > 0,05Гематокрит41,77,244,53,542,26,8р > 0,05Числопораженныхсосудов1,20,51,10,31,20,5р > 0,05Процентингибированиятромбоцитов (PI)%30,620,018,216,428,620,00,0133,33,33,12,03,33,1р > 0,052,70,93,00,32,80,8р > 0,05различийв6-бетагидроксикортизол/кортизолДиаметр стентаПриисследованииколичественныхпеременныхмеждуносителями генотипов СС, СТ и ТТ гена ABCB1 с применением критерияКраскала-Уоллеса, статистически значимых различий не обнаружено (Таблица 17).81Таблица 17 - Оценка различий между генотипами ABCB1 с помощью критерияКраскала-Уоллеса для переменных с ненормальным распределением.ИтогоABCB1ПоказателиCCCTpTTМσМσМσМσ12345678910Лейкоциты9,02,88,92,49,22,79,02,5р>0,05Тромбоциты208,555,5228,265,0243,273,2226,464,6р>0,05Гемоглобин139,615,4143,318,6140,916,3142,117,5р>0,05Общийхолестерин4,91,35,31,24,91,15,21,2р>0,05ЛПНП2,61,03,01,12,81,52,91,2р>0,05Триглицериды1,50,31,70,62,01,11,70,7р>0,05Креатинин110,018,8102,420,7109,620,7105,120,4р>0,05Глюкоза6,12,47,07,07,12,26,85,7р>0,05Гематокрит41,38,042,73,741,212,642,26,8р>0,058212345678910Числопораженныхсосудов1,20,41,10,41,50,91,20,5р>0,05Процентингибированиятромбоцитов(PI) %20,06-бетагидроксикортизол/кортизолДиаметрстентаПо31,621,728,318,128,620,03,12,73,33,43,22,63,33,12,80,72,70,82,91,02,80,8результатамединственным13,1однофакторногофактором,дисперсионногостатистическизначимоанализар>0,05р>0,05р>0,05(ANOVA)различающимсямеждуносителями нормального генотипа CYP2C19*1/*1 (экстенсивные метаболизаторы)и генотипа CYP2C19*1/*2 оказался абсолютный уровень остаточной активноститромбоцитов PRU: 168,7±55,5; ДИ:155,3-182,1; размах: 9,0-294,0 vs.
202,9±61,1;ДИ:166,0-239,9; размах: 86,0-284,0 р = 0,048 (Таблица 18).Таблица 18 - Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) для оценкизначимости различий средних значений основных показателей между генотипамиCYP2C19.Параметр1ГенCYP2C1995% ДИN23М4σ5Мин МаксSD6НГВГ78910р118312345678910Возраст*1/*16864,511,11,361,867,237,091,0110,342Рост*1/*21361,310,02,855,267,447,084,0Итого8164,010,91,261,566,437,091,0*1/*1681,70,10,01,71,71,51,90,613Вес*1/*2131,70,00,01,71,71,61,8Итого811,70,10,01,71,71,51,9*1/*16880,99,91,278,583,362,0102,00,806ИМТ*1/*21380,211,23,173,486,960,098,0Итого8180,810,11,178,683,060,0102,0*1/*16827,93,10,427,128,622,835,60,834*1/*21327,73,61,025,529,822,934,7Итого8127,83,20,427,128,622,835,6*1/*16851,828,43,444,958,710,399,8Концентрация*1/*2кортизола(нг/мл) Итого0,3711344,320,65,731,956,719,784,28150,627,43,044,556,610,399,8Концентр *1/*1ация 6бета*1/*2гидроксикортизола Итого(нг/мл)68109,650,66,197,4121,920,5199,8*1/*10,98813109,842,411,884,2135,518,7198,281109,749,15,598,8120,518,7199,868168,755,56,7155,3 182,19,0294,00,048*1/*213202,961,117,0166,0 239,986,0284,0Итого81174,257,46,4161,5 186,99,0294,0PRU841БазовоеPRU234567891011*1/*168239,633,94,1231,4 247,8 153,0 335,0 0,543*1/*213233,236,310,1211,3 255,2 167,0 288,0Итого81238,534,13,8231,0 246,1 153,0 335,0Статистически значимых различий между генотипами СС, СТ и ТТ генаABCB1 по результатам однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) невыявлено (Таблица 19).Таблица 19 - Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) для оценкизначимости различий средних значений основных показателей между генотипамиABCB1.SDПараметр1ГенABCB1NМ2345CC1764,3CT5162,495% ДИσМин МаксНГВГ67891012,02,958,170,538,084,010,41,559,565,337,091,0рВозраст110,091TT1369,810,42,963,576,051,087,0Итого8164,010,91,261,566,437,091,0CC171,70,00,01,71,71,61,8CT511,70,10,01,71,71,61,9TT131,70,10,01,71,81,51,8Итого811,70,10,01,71,71,51,9Рост0,5538512345678910CC1778,68,72,174,183,060,095,0CT5181,110,71,578,184,162,0102,0Вес0,564TT1382,39,72,776,488,265,095,0Итого8180,810,11,178,683,060,0102,0CC1727,02,20,525,928,122,930,1CT5128,13,50,527,129,122,835,6TT1328,03,30,926,029,923,535,1Итого8127,83,20,427,128,622,835,6CC1753,131,47,637,069,212,999,8CT5149,725,53,642,556,910,397,3ИМТКонцентрациякортизола(нг/мл)Концентрация 6бетагидроксикортизола(нг/мл)PRU110,4910,908TT1350,630,98,631,969,312,298,4Итого8150,627,43,044,556,610,399,8CC17109,6 40,09,789,0130,234,0185,6CT51110,4 53,47,595,4125,418,7199,80,973TT13106,8 45,312,679,4134,141,7181,5Итого81109,7 49,15,598,8120,518,7199,8CC17192,5 38,59,3172,7 212,3 147,0 284,0CT51171,3 64,29,0153,2 189,39,0294,00,297TT13161,8 46,712,9 133,6 190,080,0233,0Итого81174,2 57,46,49,0294,0161,5 186,98612345678910БазовоеPRUCC17237,2 36,08,7218,7 255,7 167,0 291,0CT51242,5 34,64,9232,7 252,2 153,0 335,0110,25TT13224,8 27,67,7208,1 241,5 165,0 267,0Итого81238,5 34,13,8231,0 246,1 153,0 335,0Линейный регрессионный анализ показал, что меньшее значение среднегодиаметра стента незначительно снижает риск развития высокой остаточнойреактивности тромбоцитов (Таблица 20).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
