Диссертация (1139975), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Самоидентификация субъекта, как представителя этнической группырусских3. Информированное согласие на участие в письменной формеКритерии исключения для популяционной части исследования:1. Рождение в межнациональных бракахРисунок 9 – Гендерный состав этнических групп.Таблица 8 – Возрастной состав этнических групп.ЭтническаягруппаNМинимумМаксимумМσ123456Аварцы9016,0070,0023,14448,4926464123456Лакцы4618,0046,0022,06525,12685Даргинцы5016,0053,0022,32006,36457Русские14619,0060,0038,095910,734622.3. Методика измерение остаточной реактивности тромбоцитовоптической детекцией агглютинации тромбоцитов (прибор VerifyNow)Забор цельной крови из локтевой вены для измерения агрегации тромбоцитовосуществлялся на 3-5 сутки после ОКС и ЧКВ. Для забора крови использовалисьвакуумные пробирки Greiner Bio-One Vacuette (Greiner Bio-One, Асвтрия) на 2 мл с3,2% цитратом натрия.
Исследование проводилось в течение 1 часа после взятияобразца цельной венозной крови. У пациентов, получавших ингибиторыгликопротеина IIb-IIIa, агрегация оценивалась не ранее 5–6 дней после окончаниявнутривенноговведенияпрепарата.Измерениеостаточнойреактивноститромбоцитов осуществлялось на тест-системе для прикроватной оценки активноститромбоцитов —VerifyNowP2Y12(«Аccumetrics»,США),преимущества,недостатки которой представлены в таблице 2. Ниже приводится стандартнаяметодика измерения активности тромбоцитов, описанная в инструкции поэксплуатацииприбора(www.accumetrics.com).Каждыйтест-картридж,предназначенный для отдельного пациента, содержит лиофилизат, состоящий измикросфер покрытых человеческим фибриногеном, и агонист тромбоцитов аденозиндифосфат (АДФ).
Тестирование агрегации основано на способности GPIIb/IIIa рецепторов на активированных тромбоцитах связываться с микросферами,покрытыми фибриногеном человека. При этом активированные тромбоцитыподвергаютсявоздействиюмикросферамипокрытымифибриногеном,агглютинация происходит пропорционально числу имеющихся тромбоцитарных65рецепторов. Прибор предназначен для измерения развивающейся при этомагглютинации по пропорциональному увеличению прохождения света.
При этомвозможно использование прибора, как в лаборатории так и у постели больного. Врезультате тестирования определяется абсолютная степень агрегации тромбоцитовединицах реакции (PRU) и процентах ингибирования (IP). PRU рассчитывается поскорости и степени агрегации тромбоцитов, стимулированной АДФ. Процентингибирования(PI)показываетизменениеотначальнойагрегации,ирассчитывается исходя из результата PRU и базового результата. Базовыйрезультат является независимым измерением, основанным на скорости и степениагрегации тромбоцитов при стимуляции рецепторов тромбина (PAR-1 и PAR-4).Оптимальные границы «терапевтического окна» для каждого метода,указанные на рисунке 10регламентированы в соответствующем консенсусе,основываясь на результатах предыдущих исследований (Tantry US, 2013).
Приэтом, оптимальным диапазоном остаточной активности тромбоцитов, прииспользовании прибора VerifyNow является не более 208 и не менее 85 PRU(Campo G, 2011; Price M, 2012). Соответственно, при PRU больше 208 существенновозрастает риск тромботических осложнений (Price M, 2012), и при PRU меньше85, соответственно, кровотечений (Campo G, 2011).66Рисунок 10 - Границы «терапевтического окна» применения блокаторовP2Y12-рецепторв для различных методов измерения агрегации тромбоцитов.(Адаптировано из: P.W.A. Janssen, J.
M. ten Berg, C. M. Hackeng. The use of plateletfunction testing in PCI and CABG patients // Blood Rev. – 2014. - № 28. – С. 109–121).2.4. Определение полиморфизма rs4244285 гена CYP2C19 иrs1045642 гена ABCB1Для генотипирования использовали венозную кровь, собранную на 3-5 суткипосле ЧКВ в вакуумные пробирки VACUETTE® (Greiner Bio-One, Асвтрия) сэтилендиаминтетраацетатом (ЭДТА).
Носительство полиморфных маркеров генаCYP2C19 и ABCB1 выявлялось методом полимеразно-цепной реакции в реальномвремени (Real-Time PCR) на приборах CFX384 Touch Real-Time PCR DetectionSystem (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) и Applied Biosystems StepOne™ (LifeTechnologies, USA).Определение генетических полиморфизмов проводилось в несколько этапов:1. Выделение геномной ДНК из лейкоцитов цельной крови;672. Проведение аллель-специфичной ПЦР;3. Анализ и интерпретация результатов.Процесс выделения ДНК проводился с помощью реагентов для выделениягеномной ДНК из цельной крови «ДНК-ЭКСТРАН-1» (ЗАО «Синтол», Россия).Праймеры для ПЦР были подобраны с помощью программы Primer Select4.05©1993–2000 DNASTAR Inc и синтезированы ЗАО «Синтол» (Россия).Последовательность праймеров:1.
rs4244285 (G681A,*2): прямой 5′-AGAAGAATTGTTGTAAAAAGTAAG-3′,обратный 5′-ATAAAGTCCCGAGGGTTGTTGATG-3′.2. rs4986893 (G636A,*3): прямой 5′-GATCAGCAATTTCTTAACTTGATG-3′,обратный 5′-GACTGTAAGTGGTTTCTCAGGA-3′3. rs1045642 (Т3435С): прямой 5′-GATCTGTGAACTCTTGTTTCA-3′, обратный3′-GAAGAGAGCTTACATTAGG-5′.Использованное оборудование и расходные материалы:1. Прибор для ПЦР-РВ.2.
Микроцентрифуга-встряхиватель.3. Микропипетки переменного объема на 10 и 100 мкл.4. Пробирки на 1,5 мл.5. Пробирки для ПЦР на 0,2 мкл.6. Наконечники с фильтром к микропипеткам.Подготовка и проведению реакции ПЦРРеактивы для амплификации ДНК (2,5хреакционная смесь, 2,5хразбавительи Taq-полимераза), смешивались в нужном объеме (Таблица 9) непосредственнопередпроведениемисследования.Необходимыйобъемкомпонентов,68рассчитывался исходя из количества исследуемых образцов плюс 4 (триположительных и один отрицательный контрольный образец).Таблица 9 - Расчет необходимого объема реагентов для реакцииамплификации.№НаименованиеОбъем на реакцию, мкл12.5 х Реакционная смесь1022.5 х Разбавитель103Taq ДНК-полимераза 5 Е/мкл0,5Подготовка проб к амплификации:1.
Разморозка компонентов, перемешивание и центрифугирование.2. Приготовление смеси компонентов, добавляя их в порядке, указанном втаблице, перемешивание и центрифугирование3. Маркировка пробирок в соответствии с протоколом исследования.4. Внесение в ПЦР пробирки по 20 мкл смеси компонентов.5. Добавление в каждую ПЦР пробирку по 5 мкл контрольных и исследуемыхобразцов в соответствии с маркировкой.6. Кратковременно центрифугирование.7. Постановка пробирок в прибор в соответствии с протоколом исследования.Программа амлификации для всех полиморфизмов:1.
95,0 С - 3:00 мин2. 95,0 C - 0:15 мин3. 63,0 C - 0:40 мин4. Чтение плашки5. Повторение 40 циклов6. Завершение69Для определения однонуклеотидного генетического полиморфизма rs4244285(G681A, *2) гена CYP2C19 и полиморфизма rs1045642 (Т3435С) гена ABCB1использовались наборы (Таблицы 10, 11) "SNP- Скрин" (ЗАО «Синтол», Россия) и«Клопидогрел 1» и «Клопидогрел 2» (ООО НПФ «Литех», Россия). В каждомнаборе использовалось два аллель-специфичных зонда, которые позволилираздельно детектировать сразу два аллеля исследуемого полиморфизма на двухканалах флуоресценции. Результаты реакции на двух каналах позволяютоднозначноопределитьприсутствиекаждогоизаллелейисследуемогополиморфизма. Такие зонды позволяют получить оптимальное разрешение иуровень сигнала при заданной температуре реакции, так как проводился ихтщательный подбор с использованиемспециальных алгоритмов, путем введениямодификацийивпоследовательностьконтролемреальнойразрешающейспособности.Таблица 10 - Набор реагентов для определения полиморфизма G681A(rs4244285, *2) и G636A (rs4986893, *3) гена CYP2C19.№НаименованиеОбъем12.5 х Реакционная смесь1000 мкл22.5 х Разбавитель1000 мкл3Taq ДНК-полимераза 5 Е/мкл50 мкл4ДНК положительный контроль 1 G/G50 мкл5ДНК положительный контроль 2 G/A50 мкл6ДНК положительный контроль 3 A/A50 мкл7Отрицательный контроль200 мкл70Таблица 11 - Набор реагентов для определения полиморфизма T3435C генаABCB1 (rs1045642).№НаименованиеОбъем12312.5 х Реакционная смесь1000 мкл22.5 х Разбавитель1000 мкл3Taq ДНК-полимераза 5 Е/мкл50 мкл4ДНК положительный контроль 1 С/С50 мкл5ДНК положительный контроль 2 С/С50 мкл6ДНК положительный контроль 3 Т/Т50 мкл7Отрицательный контроль200 мклАнализ и интерпретация результатов (Таблица 12,13).
Результаты анализапо определению однонуклеотидного генетического полиморфизма rs4244285(G681A, *2) и G636A (rs4986893, *3) гена CYP2C19 исходя из расположениякривых на графике, позволяют дать три типа заключений: нормальная гомозигота сгенотипом G/G (*1/*1), гетерозигота с генотипом G/A (*1/*2 или *1/*3соответственно), мутантная гомозигота с генотипом A\A (*2/*2 или *3/*3соответственно).Результатыанализапоопределениюоднонуклеотидногогенетического полиморфизма rs1045642 (Т3435С) гена ABCB1 исходя израсположения кривых на графике, позволяют так же дать три типа заключений:нормальная гомозигота с генотипом С/С, гетерозигота с генотипом Т/С, мутантнаягомозигота с генотипом Т\Т.71Таблица 12 - Интерпретация результатов по полиморфизмам G681A(rs4244285, *2) и G636A (rs4986893, *3) гена CYP2C19.Аллель 1 (FAM)Аллель GГенотип G/GГетерозиготаАллель G + Аллель AГенотип G/AАллель AГенотип A/A(FAM+HEX)Аллель 2 (HEX)Таблица 13 - Интерпретация результатов полиморфизма T3435C генаABCB1(rs1045642).Аллель 1 (FAM)ГетерозиготаАллель ТГенотип Т/ТАллель Т + Аллель СГенотип Т/САллель СГенотип С/С(FAM+HEX)Аллель 2 (HEX)2.5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
