Диссертация (1139911), страница 6
Текст из файла (страница 6)
веса животного). Через 5 минутпосле введения анестетика, в состоянии наркоза, крысу укладывали наоперационный стол в положении на спине, передние и задниеконечности фиксировались растяжками к специальным держалкам.Операционное поле обрабатывалось 70% спиртом. Слева отгрудины по среднеключичной линии определялся верхушечный толчок.В его проекции острыми ножницами рассекалась кожа. Разрез проходилпараллельно краю ребра, его длина составляла 1 см.Затем по верхнему краю V ребра на расстоянии 0,5 см от грудинычерез межреберные мышцы в грудную полость вертикально вводилсялазерный стерильный моноволоконный кварцевый световод. Присоприкосновении с поверхностью сердца сердечные сокращенияпередавались на световод, который начинал вибрировать.
В этот моментосуществлялось воздействие лазером в режиме коагуляции (980нм,время 5с, мощность 0,5 Вт в непрерывном режиме). При окончании34воздействия световод извлекался из грудной полости, хирургическаярана ушивалась шелковыми обвивными швами.Послеоперационный период у всех животных протекал безосложнений. Стандартизированные параметры воздействия позволилиполучать очаг коагуляции мелких сосудов и эпикарда в бассейненисходящей коронарной артерии на поверхности левого желудочкадиаметромоколо 0,2 см сразу после операции. Очаг повреждениямиокарда формировался в течение первых суток и увеличивал свойдиаметр в 1,5-2 раза по сравнению со сформированной зонойкоагуляции, дополнительно захватывая более глубокие слои.2.3Моделированиедиффузныхишемическихизменениймиокарда крыс.Ишемические изменения в миокарде крыс моделировали путемсоздания условий гиподинамического стресса [Рузов И.М., Даукша К.К.,1990].
Крысы помещались в индивидуальные узкие лотки, резкоограничивающие свободу движений, где выдерживались в условияхгиподинамии по 6 часов в сутки в течение 1 месяца. Состояниеживотных, оцениваемое визуально, после извлечения их из лотковзначительноухудшалось.Отмечалсятреморконечностей,взъерошивание шерсти, вялость, повышенная жажда. Некоторые особигибли на 2-3 сутки опыта.2.4 Лазерное воздействие на зоны локализации красногокостного мозгаВкачествеисточниковлазерногоизлученияиспользовалидиодный лазер “ИРЭ-Полюс” (Россия) с длиной волны 980 нм идиодный лазер «Лахта-Милон»( Россия) с длиной волны 670 нм.Доставку лазерного излучения к объекту осуществляли с помощьюкварцевого моноволоконного световода диаметром 600 мкм.
Выходную35мощность на торце световода и головки излучателя контролировалиизмерителем мощности лазерного излучения Gentec TPM-300-CE(Canada).Сеансы лазерного воздействия начиналипослеокончаниямоделирования повреждения миокарда. При диффузном повреждении –на следующий день после завершения гиподинамии (т.е. 31 сутки), прилокальном повреждении - через 1 сутки после операции.Сеансы лазерного воздействия проводились ежедневно, в течение10 суток, в дистанционном сканирующем режиме на зоны локализациикрасного костного мозга (бедренные кости, тазовые кости, пояснично крестцовый отдел позвоночника, хвост), воздействие осуществлялосьчерез шерсть и кожу, мощность 1 Вт, по 1 минуте на зону.2.5Морфологическиеиморфометрическиеметодыисследования миокарда.Для оценки морфологии проводилась фиксация препаратов тканей10% нейтральным формалином.
После стандартной гистологическойпроводки,приготовленияокрашивалисьпарафиновыхблоков,гематоксилином-эозином.срезытканейДополнительноишемизированный миокард окрашивался по ГОФПК (гематоксилин,основной фуксин, пикриновая кислота) и Ван- Гизон.Определение экспрессии фактора роста сосудистого эндотелияпроводилось иммуногистохимическим методом с использованиемантител к фактору роста сосудистого эндотелия (Sigma), и системыImmu-markTM(ICN), метку щелочной фосфатазой выявляли нафтоловымметодом с окраской быстрым синим ВВ (ICN).Микроскопия объектов проводилась на микроскопе Leika DMRXA(Германия) с использованием увеличений 100, 200, 400 и 1000 (маслянаяиммерсия).36Морфометрические исследования проводились на аппаратнопрограммном комплексе Диаморф Цито® (Санкт-Петербург, Россия),осуществляющемцифровоепреобразованиегистопрепаратов,компьютеризированныйвидеоизображенияподсчетпараметроввыбранных объектов и статистическую обработку полученных данных спомощью комплекта программ Диаморф Ипсо®.Для морфофункциональной оценки тучных клеток парафиновыесрезыокрашивалисьметахроматическоетолуидиновымокрашиваниесиним(pHкислых2,0),дающимгликозаминогликанов,содержащихся в гранулах тучных клеток.
Подсчитывали общееколичество тучных клеток на поле зрения. Дегрануляция тучных клетокизучалась при х400. В препаратах подсчитывалось соотношениеколичества дегранулировавших тучных клеток к их общему числу(индексдегрануляции;дегранулированныхИД=Д/(Д+Н),тучныхклеток,гдеДН––количествоколичествонедегранулированных тучных клеток.) в 10 полях зрения. С помощьюпрограммы «ДиаМорф Cito_W» определялась интегральная оптическаяплотность тучных клеток.2.6. Морфофункциональная оценка сосудистого руслаС помощью компьютеризированной программы анализа световогоизображения и программы «ДиаМорф Cito_W» в 10 полях зренияподсчитывалась доля площади препарата, занятая сосудами, а такжеизмерялся просвет сосудов (радиус капилляров, диаметр вен и артерий),толщина сосудистой стенки и рассчитывался индекс Керногана(соотношение толщины стенки и диаметра просвета).Оценка показателей микроциркуляции тканей производилась сиспользованием прибора ЛАКК-01 (Россия) на основе инфракрасноголазерасиспользованиемтрехканальногосветовогозонда,смонтированного из кварцевых моноволоконных световодов.
Животные37при измерении показателей были анестезированы золетилом, как ужеописывалось выше. Грудная клетка вскрывалась вдоль реберного краягрудиныслева.Показателиснималисьдатчиком,приложеннымнепосредственно к поверхности сердца. Время записи ЛДФ-граммысоставляло 60 секунд. Математическая обработка показателей прибораосуществлялась с использованием комплекта программ ООО «Лазма»(Россия).Определялся показатель микроциркуляции, который являетсяфункцией от усредненной скорости эритроцитов (Vср) и концентрацииэритроцитов в зондируемом объеме тканей (Nэр), зависящей отпоказателя гематокрита и количества функционирующих сосудов:ПМ= Nэр x VсрВеличина ПМ измерялась в относительных перфузионныхединицах (пф.ед.)Определение индекса эффективности (флакса) микроциркуляции,являющегося соотношением амплитуды медленноволновых процессов(параметры активных механизмов регуляции тонуса микрососудов) исуммы амплитуд дыхательных и сердечных волн (пассивная регуляциятонуса сосудов, представленная колебаниями средней и высокойчастоты) производилось в автоматическом режиме при записи ЛДФграммы.2.7 Оценка желатинолитический активности (зимографияматриксных металлопротеиназ в агарозном геле с внедреннымсубстратом)Приготовление пробы: кусочки ткани миокарда помещали вмикропробирку, взвешивали на электронных весах и добавляли равноепо массе количество гомогенизирующего буфера, приготовленного пообщепринятой методике [Tyagi S.
et al., 1996]: 20мМ CaCl2; 150mMNaCl; 0,01% Triton X-100; 50 mM Tris-Cl (рН 6,8). Препарат ткани сердца38гомогенизировали в течение 5 минут и использовали для дальнейшегоисследования.Приготовление геля: на водяной бане готовился 1% растворагарозы (ICN) на кальциевом буфере (20 mM CaCl2; 150 mM NaCl;50mM Tris-Cl, pH 7,4) с добавлением 0,2% желатина. После полногорастворения гель заливали в «сэндвич» из стекол, ширина зазора междукоторыми (1мм) была ограничена пластиковыми спейсерами.
Гельоставляли для застывания при комнатной температуре.Процедура зимографии: через 0,5 часа после застывания гельснимали со стекол, разрезали на части, помещали в чашки Петри и припомощи автоматической пипетки наносили пробы гомогенизата по 10мкл. Чашки Петри закрывали и помещали в термостат при температуре37о С на 16 часов.Фиксация полученных зимограмм осуществлялась в 20% уксуснойкислоте в течение 30 мин, окрашивание геля производилось CoomassieBrilliant Blue R-250.Затем проводилась отмывка окрашенного геля в 7% уксуснойкислоте.
После отмывки гель сканировался в стандартных условиях впроходящем свете, и на сканированных изображениях определялияркость области лизиса (оптическую плотность) с помощью программыанализа изображений «Imagescope M».2.8 Оценка показателей периферической кровиИсследование показателей периферической крови проводилось всоответствии с требованиями клинико-гематологического обследования.Количество эритроцитов и лейкоцитов определяли унифицированнымметодом подсчета в камере Горяева, гематокрит - микрометодом сиспользованиемстандартныхгепаринизированныхкапилляровицентрифуги МЦГ-8.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
