Диссертация (1139891), страница 7
Текст из файла (страница 7)
После переносили суспензию во флакон 75 см3 и инкубировали при37°С в СО2-инкубаторе. На следующий день отмывали флакон отэритроцитов фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), доливали 25мл ростовой среды и культивировали до 70 – 80% конфлюентности (сменасреды производилась каждые 3-4 дня). После достижения 70 – 80%конфлюентности отмывали культуральный флакон стерильным растворомPBS от сыворотки, содержащейся в культуральной среде. Добавилираствортрипсинас0,25%ЭДТА(StemCellTechnology,США)инкубировали при 370 С около 5 минут до полного отделения клеток отпластика. Фермент инактивировали добавлением отмывочной среды(DMEMF12 + 10% FBS (BioInd) + пенициллин 100 ед/мл + стрептомицин100 мкг/мл + L-глютамин 2 мМ) и переносили в 50 мл стерильнуюпробирку.
Центрифугировали 7 мин при 300g. После осаждения клеток,осадок ресуспендировали в среде культивирования. Производили подсчетклеток с оценкой жизнеспособности на автоматизированном счетчикеCountess (Invitrogen, Korea) по методике производителя. Полученнуюсуспензию клеток высевали на культуральный пластик из расчета 3-5х10344кл. на см2. Экспансия клеточной культуры проводилась до 70 – 80%монослоя по стандартной методике культивирования клеточных культуриз костного мозга. После достижения культурой клеток 70 – 80%конфлюентностиклеткиснималиферментативнымспособомипроизводили подсчёт клеток. Полученные клетки дважды отмывали вфосфатно-солевом буфере, супернатантнеобходимымколичествомудаляли, осадок разводилифизиологическогораствора,хорошоресуспендировали и распределяли по стерильным колбам, измеряласьжизнеспособность клеток (должна быть более 90%).
В каждой колбеконцентрация клеток составляла 5млн/мл.В исследовании использовали 3 пассаж клеток (рисунок 2.) ФенотипММСК КМ подтвержден при помощи проточной цитометрии.Рис. 2. Пассаж ММСК КМ. А – пассаж 0 ММСК КМ. Б - пассаж 3ММС КМ2.3 Техника операций2.3.1 Резекция 70% печениРезекция 70% печени у крыс выполнена по методике G.M. Higgens,R.M. Anderson [60]. Под в/м анестезией раствора Золетила, из расчета 15мг/кг веса, выполняли верхнюю срединную лапаротомию длиной 3 - 4 см.45Срединную и левую переднюю доли печени выводили в рану, долевыесосуды перевязывали у основания и доли удаляли (рисунок 3, 4, 5).Удаленная часть составляла 2/3 (67 – 70%) от общей массы печени(рисунок 3, 5). Лапаротомный разрез ушивали наглухо непрерывнымшвом.2.3.2 Резекция 85% печениРезекцию 85% печени выполняли по стандартной методике (послевыполнения резекции 70% печени по описанной выше методике, выделялисальниковые доли, правую переднюю долю печени, перевязывали долевыесосуды у основания и доли удаляли (рисунок 3, 6)) [178].
Лапаротомныйразрез ушивали наглухо непрерывным швом.231Рис. 2.4Анатомия печени крысы. 1 - соотношение массы долейпечени ко всей печени в %. (А – срединная передняя доля печени; Б левая передняя доля печени;В – правая задняя доля печени; Г -правая передняя доля печени; Д –Е - сальниковые доли печени.).
2 резекция 70% печени; 3 –резекция 85% ; 4 - резекция 90% [18; 172]462.3.3 Резекция 90% печениРезекцию 90% печени выполняли по стандартной методике под в/мнаркозом раствора золетила 15 мг/кг.Выполняли резекцию 70% печени пометодике описанной выше и дополнительно удаляли правую переднюю иправую заднюю доли печени (рисунок 3, 6) [164]. После 90% резекциипечени, в брюшную полость вводили 5% раствор глюкозы (из расчета 5%от массы тела), в дальнейшем ежедневно подкожно вводили 5% раствораглюкозы (из расчета 5% от массы тела) в течение 7 дней, к питьевой водедобавляли сахар (для получения 20% раствора глюкозы). Добавлениеглюкозыпривыполнениипредельнобольшихрезекцийпеченинеобходимо с целью исключения смерти животных от гипогликемическойкомы [55].Рис.
4. Анатомия печени (крыса). А – здоровая печень крысы. Б– выделенный сосудистый пучок идущий к срединной и левой долипечени47Рис. 5. Резекция 70% печени. А – резекцированные 70% печени.Б – резекция 70% печениРис. 6. Резекция 85% и 90% печени. А – резекция 85% печени. Б– резекции 90% печени2.4 Техника введения мезенхимальных мультипотентныхстромальных клеток костного мозгаВремя от получения ММСК КМ до введения сотавляло не более 3часов. После выполнения резекции паренхимы печени крысам в нижнююполую вену вводили 0,5 мл раствора NaCL 0,9% (B.Braun, Германия) саллогеннымиММСККМ(2,5млн).Непосредственнопередтрансплантацией раствор в колбе перемешивали, набирали в инсулиновый48шприц 0,5 мл и вводили в НПВ. Продолжительность введения составляла 3- 5 минут.2.5 Оценка эффективности клеточного продуктаАнализ летальности и продолдительности жизниЛетальность и выживаемость оценивали 2 раза в день в 6.00 и 18.00после операции.
Летальность оценивали в процентах от общего числапрооперированных в группе. Продолжительность жизни в часах послеоперации.Анализ массы крысы и печени.Измерение массы выполнены на весах OhausAdventureProAV413(Китай). Массу крысы измеряли до операции и в момент вывода изэксперимента, анализу подвергалась разница. Массу «регенерированной»печени измеряли в процентах от общей массы печени по формуле % = A/(B/0,7), где A = масса печени в момент вывода из эксперимента и B = массарезецированной печени.Анализ синтетической функции и концентрации печеночныхферментовОпределяли концентрацию в крови: прямой билирубин, общийбелок, альбумин, активированное частичное тромбопластиновое время(АЧТВ),международноеаланинаминотрансферазанормализованноеотношение(МНО),(АЛТ),аспартатаминотрансфераза(АСТ),щелочная фосфатаза (ЩФ).
Анализ крови выполнен на анализаторахOlympusAU680 (BeckmanCoulter, США) и SysmexCs-2100i (Япония).Использованы стандартные анализаторы, которые применялись в клинике.2.6 Морфология и морфометрияМорфометрический анализ был произведен тремя исследователями спомощью морфометрической окулярной сетки на микроскопе Микмед-5(Россия) при увеличении х400.49Определение количества митозов.Материал фиксировали 4%фармальдегидом в течение 24 часов, затем заливали в парафин, 5микрометровыесрезыдепарафинизировалиификсировали,осуществлялась окраска гематоксилином/эозином.
Определяли суммарноеколичество митозов в 5 полях зрения.Определение диаметр ядра гепатоцитов. Диаметр ядра измерялипри окраске гемотоксилином и эозином в 5 полях зрения.Определениеплощадигепатоцитов.Площадьгепатоцитовопределяли при окраске гематоксилином и эозином в 5 полях зрения.Измеряли продольный и поперечный размер гепатоцита. Анализуподвергалось произведение 2 размеров.Определениеразмерапеченочныхдолек.Классическуюпеченочную дольку мы представили в виде правильного шестиугольника, вцентре которого располагается центральная вена, а по углам - портальныетракты. Площадь правильного шестиугольника вычисляется по формуле:S= 3*l2√3/2, где S-площадь шестиугольника, l-длина одной из стороншестиугольника (измерялось расстояние между двумя близлежащимипортальными трактами).
Проводили измерение не менее 25 портопортальных расстояний.Данные приведены в процентах по отношению кморфометрическим показателям здоровой печени.ОпределениеколичестваPCNAпозитивныхклеток.Парафиновые срезы печени крысы окрашивали антителами к PCNA (клонPC10, DAKO, Denmark; разведение 1:100). Окрашивание проводилистрептавидин-биотиновым методом. Высчитывали среднее процентноеколичество позитивных клеток в 5 полях зрения при увеличение 400х.502.7 Статистическая обработка данныхСтатистическуюпомощьюобработку полученныхпрограммногообеспеченияSPSSданных22проводилидлясWindows.Количественные данные представляли в виде медианы и межквартельногоразмаха.Длясравнениязначенийколичественныхпризнаковвнезависимых группах использовали непараметрический критерий МаннаУитни.
Выживаемость лабораторных животных в группах оценивали спомощью метода Каплана-Мейера и сравнивали между собой, используялогарифмический ранговый критерий. Различия признавали статистическизначимыми при значении p<0,05.51ГЛАВА 3. Разработка оптимальной экспериментальной моделипострезекционной печеночной недостаточности.В ходе первого этапа определяли оптимальную экспериментальнуюмодель пострезекционной печеночной недостаточности для изученияфункциональных и морфологических параментов ее регенерации, а так жедля оценки летальности и продолжительности жизни.3.1 Влияние 70% резекции печени на летальность ипродолжительность жизниПри выполнении 70% резекции печени все крысы прожили 21 суткиибыливыведеныизэксперимента(табл.4,рисунок7,9).Рис.
7. Регенерированная печень крысы на 21 сутки после 70% и 85%резекции печени. А – печень на 21 сутки после 70% резекции печени.Б – печень на 21 сутки после 85% резекции печени3.2 Влияние 85% резекции печени на летальность ипродолжительность жизниПри выполнении 85% резекции печени все крысы прожили 21 суткии были выведены из эксперимента (табл. 4, рисунок 7,9).52Таблица 4Определение предельно больших объемов резекции печени укрыс в экспериментеОперацияМедиана (ч) Процентили (25 % - 75 %) Летальность (%)Резекция 70% печени504504 – 5040Резекция 85% печени504504 – 5040Резекция 90% печени1212 – 241003.3 Влияние 90% резекции печени на летальность ипродолжительность жизниПри выполнении резекции 90% печени все животные погибли втечение 2 суток после операции (табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
