Диссертация (1139891), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Меченые антитела образуюткоторыевыявляютсяприпомощифлюресцентной микроскопии [161]. В ряде работ применялись антителамеченые зеленым флуоресцентным белком (ЗФБ) [21; 41; 88; 106; 128; 161;182]. Так, при ксенотрансплантации гепатоцитов в селезенку крысы после3690% резекции печени, введённые клетки обнаруживали в печени, вселезенке [175].Трансмиссионная электронная микроскопия.При помощи данногометодаизучаютсостояниецитоплазмы,органелл,ядер,желчныхканальцев, пространства Диссе, синусоидальных эндотелиальных клеток,частиц гликоген присутствие апоптоза и т.д.[128; 175; 182].Окраска гематоксилином и эозином и трихромное окрашивание поМассону.Окраска гематоксилином и эозином используется для оценкистепени воспаления паренхимы печени, при подсчете числа митозов иморфометрии.
При морфометрии оценивали преимущественно площадьгепатоцитов, печеночных долек после резекции печени [1; 21; 28; 42; 111;182].ТрихромноеокрашиваниепоМассонуиспользуетсядлядифференцировки клеточных и внеклеточных структур, в работахиспользовали для окрашивания скопления коллагена в печени у крыс примоделировании ОПН при помощи облучения [182].Оценка повреждения печени по активности ферментовДанный метод в настоящее время нашел широкое применение изаключается в определении активности печеночных ферментов в крови,таких как: аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы(АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) и гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ)[41; 128; 137; 180; 182].
Преимуществом данного метода является егопростота,специфичностьиприменимостьвусловияхклиники.Недостатком метода является его не высокая чувствительность.Другие методыВестерн-блоттинг – аналитический метод, используемый дляопределения специфических белков в образце участвующих в регенерации37печени (Akt, GSK, TNF-a, SDF-1a, VEGF, GAPDH, p-AMPK)[22; 119; 128;161; 182].Нозернблоттинг - в отличие от вестернблоттинга используетсяэлектрофорез РНК.
Данный метод применяется для выделения и анализаРНК, что позволяет определить наличие экспрессии гена и количестваданной РНК. В работах при помощи данного метода определялиприсутствие клеточного продукта в исследуемом материале [106].Ферментный иммуносорбентный анализ – метод, основанный наобнаружении специфических антиген в образце. Данным методомопределяют сывороточный уровень таких факторов роста цитокинов какHGF, TNF-a, IL-6, IL10 и др., которые непосредственно участвуют впроцессе регенерации печени [85; 128; 182].Обратнаяполимеразнаяцепнаяреакция.Даннымметодомопределяли присутствие гена экспрессирующего альбумин и фактора ростагепатоцитов в исследуемом материале [106; 175; 182].Таким образом, при изучении возможности восстановления печенипод действием клеточного продукта можно использовать приличный рядметодик, таких как анализ летальности, выживаемости, массу животного,печени,оценкуповрежденияферментов,функциональные,печенипоактивностиморфологическиепеченочныхпоказатели,иммуногистохимия и др.
Следует иметь в виду, что в большинствепроанализированных работ, исследователи не ограничивались однимоценочным методом, а использовали сочетание нескольких тестов. Какправило, при подтверждении эффективности препарата на одном методе,его эффективностьподтверждалась и на другом. Мы считаем, что вэксперименте следует использовать ряд наиболее информативных ипростых методов, которые позволяет выполнить лаборатория. Таковыми38методами являются: оценка летальности, выживаемости, массы животногои печени, оценка функции печени на основании ситезируемых веществ,оценка повреждения печени по активности печеночных ферментов,гистологические методы включающие морфометрию (оценка числамитозов,диаметраядра,гепатоцитов,печеночнойдольки)ииммунгистохимию (PCNA).
Учитывая, что некоторые исследованияпроводились на разных животных и в разных условиях, окончательныйвыбор оценочного метода возможен только после их апробации исравнении на конкретной модели повреждения печени.ЗаключениеС момента развития печеночной хирургии развивалась техникаоперации, методики, оборудование, что позволяло выполнять уникальныеоперации на столь сложном органе. Несмотря на свою способность квосстановлению при выполнении ОРП, в особенности при циррозахпечени, операция часто сопряжена с развитием ОПН, что служит стимуломпоиска новых препаратов ускоряющих процесс регенерации. Былопроведено большое количество исследований с целью понять механизмырегенерации печении выяснено, что данным препаратом может быть самаклетка.В ряде работ была продемонстрирована возможность восстановленияповрежденной печени под действием различных клеточных продуктов.Однако, оценка результатов производилась путем разных методов, крометого,вотечественной литературе недостаточно работкасательноприменения клеточного продукта в эксперименте при резекциях печени, иметодов оценки его эффективности.В некоторых работахклеточныепродукты не были нацелены на возможность использования их вдальнейшемвклиническойпрактикеи/илиприменимыемодели39повреждения печени не отражали ОПН характерную для таковой послеОРП.Таким образом, несмотря на имеющиеся достижения и развитияклеточных технологий, остается много неоднозначных и нерешенныхвопросов.40ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1 Дизайн исследованияИсследование выполнено на 91 крысах - самцах породы Вистар массой 155-185 г. Медиана массы крыс составляла 173 г. Животныесодержались в виварии ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России, водинаковых условиях, при постоянной температуре окружающей среды,кормление производили стандартным лабораторным кормом. Помещение,в котором находились животные, вентилировалось с постояннымконтролем давления воздуха и температуры, соблюдался суточный цикл(12 часов день/ночь).
Накануне операции крыс не кормили, всеманипуляции выполняли в период с 7.30 до 10.30. Крыс выводили изэксперимента декапитацией под в/м наркозом раствором Золетила (смесьтилетамина,обладающиммощныманальгетическимдействиемизолазепама, обладающим выраженным седативным эффектом) из расчета15 мг/кг массы тела животного. Инъекция производилась в мышцунаружной области бедра животного или мышцы по ходу поясничногоотделапозвоночника.Экспериментприводилсяизавершалсявсоответствии с требованиями Хельсинской конвенции о гуманномобращении с экспериментальными животными (1975).Исследование состояло из 3 этапов:1 этап (табл. 1)– разработка оптимальной экспериментальноймодели пострезекционной печеночной недостаточности для изученияфункциональных и морфологических параментов ее регенерации, а так жедля оценки летальности и продолжительности жизни экспериментальныхживотных.Эта часть исследования проведена на 3 группах крыс – по 7животных в каждой группе.
Животных выводили из эксперимента на 2141сутки после операции. Группы различались по объему резекции печени: 1(A) группа – 70%; 2 (B) группа – 85%; 3 (C) группа – 90%.Таблица №1Первый этап исследованияГруппа№Количествоживотных7Объемрезекциипечени70%ТрансплантацияаллогенныхММСК КМ-А1В2785%-С3790%-ОценкаЛетальность ипродолжительностьжизниЛетальность ипродолжительностьжизниЛетальность ипродолжительностьжизниСроки выводаизэксперимента21 сутки21 суткиПосле смерти2 этап (табл. 2) – изучение влияния трансплантации аллогенныхММСК КМ на летальность, продолжительность жизни животного,функцию печени, объем ремнантапосле выполнения обширной резекциипечени в эксперименте.
Данный этап выполнен на 5 группах лабораторныхживотных: 1 (C) группа – определения летальности и продолжительностижизни после 90% резекции печени (вошли данные из первого этапаисследования). 2 (D) группа - 7 крыс с целью определения летальности ипродолжительности жизни после резекции 90% печени с трансплантацией2,5 млн аллогенных ММСК в НПВ на физиологическом растворе 0,5 мл. 3(E) группа – вошли 7 крыс для определения показателей крови в норме (на0 сутки (до резекции печени)), им выполняли лапаротомию, забор крови,печени на исследование и бедренной кости для получения ММ СК КМ. 4(F) группа - контрольная группа с резекцией 70% печени (n=28).
5 (G)группа - экспериментальная группа с резекцией 70% печени (n=28),выполняли резекцию 70% печени с трансплантации 2,5 млн аллогенныхММСК КМ в НПВ на физиологическом растворе 0,5 мл. Животных 4 и 542групп по 7 крыс выводили из эксперимента на 1, 2, 4, 14 суткиэксперимента, измеряли массу крысы, печени, выполняли забор пробкрови, печени с целью проведения дальнешего исследовани.Таблица №2Второй этап исследованияГруппа№КоличествоОбъемТрансплантацияживотных резекцииаллогенныхпечениММСК КМ790%-С1D2790%+E37Безрезекции-F42870%-G52870%+ОценкаЛетальность ипродолжительностьжизниЛетальность ипродолжительностьжизниМасса крысы,печени, б/х крови,коагулограммаМасса крысы,печени, б/х крови,коагулограммаМасса крысы,печени, б/х крови,коагулограммаСрокивывода изэкспериментаПосле смертиПосле смерти0 сутки (дооперации)1, 2, 4, 14сутки1, 2, 4, 14сутки3 этап (табл.
3) - в данную группу вошли крысы 3 (E), 4 (F) и 5 (G)группы из 2 этапа исследования,изучали влияние трансплантацииаллогенных ММСК КМ на пролиферативную, митотическую активностьгепатоцитов и морфометрические критерии регенерации паренхимыпечени после 70% резекции печени в эксперименте.Таблица №3Третий этап исследованияГруппа №КоличествоживотныхE17FG232828ОбъемрезекциипечениБезрезекции70%70%Трансплантацияаллогенных ММСККМ-ОценкаМорфология+МорфологияМорфологияСроки выводаизэксперимента0 сутки (дооперации)1, 2, 4, 14 сутки1, 2, 4, 14 сутки432.2 Получение мезенхимальных мультипотентных стромальныхклеток костного мозгаММСК КМ получены из бедренных костей крыс по стандартнойметодике[148;149].Выполнялидекапитацию,отпрепаровывалибедренную кость, отделяли диафиз от эпифизов.
Извлекали костный мозг вламинарном шкафу: в шприц набирали 5 мл среды для культивирования(DMEMF12 + 10% FBS (BioInd) + пенициллин 100 ед/мл + стрептомицин100 мкг/мл + L-глютамин 2мМ). После того как конец иглы вставляли вдиафиз,струейвыдавливаликостныймозгвпробирку,затемресуспендировали костный мозг и доводили ростовой средой объём до 25мл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
