Автореферат (1139890), страница 2
Текст из файла (страница 2)
А. И. Бурназяна ФМБА России.Апробация результатов исследованияМатериалы диссертации были доложены и обсуждены на ПервомМеждународномМедико-биологическомКонгрессекритическихсостояний"Влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на регенерациюпечени после ее обширной резекции (экспериментальное исследование)" Москва28-30 ноября 2016г. Апробация состоялась на совместном заседании кафедр:хирургии с курсами онкохирургии, эндоскопии, хирургической патологии,клинической трансплантологии и органного донорства, кафедры общественногоздоровья и здравоохранения Института последипломного профессиональногообразования ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им А.И.
Бурназяна ФМБА России с секцией побиомедицинским и клиническим технологиям Ученого совета ФГБУ ГНЦ ФМБЦим А.И. Бурназяна ФМБА России. Протокол № 2704/17-01 от 27 апреля 2017 года.Личный вклад автораАвтором самостоятельно выполнены эксперименты на лабораторных7животных,проведенаморфологическогоподготовкаисследования,образцовсобрантканейидлядальнейшегообработанпервичныйэкспериментальный материал, выполнена статистическая обработка данных,самостоятельнопроанализировангистологическийматериал,подготовленыпубликации по теме исследования (см. ниже).Соответствие диссертации паспорту научной специальностиТема диссертации соответствует паспорту номенклатуры специальностейнаучных работников по шифру 14.01.17 – Хирургия п.4 - Экспериментальная иклиническая разработка методов лечения хирургических болезней и их внедрение вклиническую практику.ПубликацииПо теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 5 в центральныхрецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.Объем и структура диссертацииДиссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит извведения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, в котором указаны 13источников публикаций отечественных авторов и 171 работ зарубежных авторов.
Втекстеимеются7таблиц,29рисунка,атакжеприведеныописаниясамостоятельных экспериментальных исследований.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫХарактеристика материала и методов экспериментального исследования.Исследование выполнено на 91 крысе - самцах породы Вистар - массой 155185 г. Медиана массы крыс составляла 173 г. Животные содержались в виварииФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И.
Бурназяна ФМБА России, в одинаковых условиях, припостояннойтемпературеокружающейсреды,кормлениепроизводилистандартным лабораторным кормом. Помещение, в котором находились животные,вентилировалось с постоянным контролем давления воздуха и температуры,соблюдался суточный цикл (12 часов день/ночь). Накануне операции крыс не8кормили, все манипуляции выполняли в период с 7.30 до 10.30.
Крыс выводили изэксперимента декапитацией под в/м наркозом раствором Золетила (смесьтилетамина, обладающим мощным анальгетическим действием и золазепама,обладающим выраженным седативным эффектом) из расчета 15 мг/кг массы телаживотного. Инъекция производилась в мышцу наружной области бедра животногоили мышцы по ходу поясничного отдела позвоночника.
Эксперимент приводился изавершался в соответствии с требованиями Хельсинской конвенции о гуманномобращении с экспериментальными животными (1975).Исследование состояло из 3 этапов:1 этап (табл. 1)– разработка оптимальной экспериментальной моделипострезекционной печеночной недостаточности для изучения функциональных иморфологических параментов ее регенерации, а так же для оценки летальности ипродолжительности жизни экспериментальных животных. Эта часть исследованияпроведена на 3 группах крыс – по 7 животных в каждой группе. Животныхвыводили из эксперимента на 21 сутки после операции.
Группы различались пообъему резекции печени: 1 (A) группа – 70%; 2 (B) группа – 85%; 3 (C) группа –90%.Таблица №1Первый этап исследованияГруппКоличеств Объем Трансплантаца№орезекци ия аллогенныхживотныхиММСК КМпечениА1770%-ОценкаСрокивывода изэксперимента21 суткиЛетальность ипродолжительность жизниВ2785%Летальность и21 суткипродолжительность жизниС3790%Летальность иПослепродолжительноссмертить жизни2 этап (табл.
2) – изучение влияния трансплантации аллогенных ММСК КМна летальность, продолжительность жизни животного, функцию печени, объемремнанта после выполнения обширной резекции печени в эксперименте. Данныйэтап выполнен на 5 группах лабораторных животных: 1 (C) группа – определения9летальности и продолжительности жизни после 90% резекции печени (вошлиданные из первого этапа исследования). 2 (D) группа - 7 крыс с целью определениялетальности и продолжительности жизни после резекции 90% печени странсплантацией 2,5 млн аллогенных ММСК в НПВ на физиологическом растворе0,5 мл. 3 (E) группа – вошли 7 крыс для определения показателей крови в норме (на0 сутки (до резекции печени)), им выполняли лапаротомию, забор крови, печени наисследование и бедренной кости для получения ММСК КМ.4 (F) группа -контрольная(G)группасрезекцией70%печени(n=28).5группа-экспериментальная группа с резекцией 70% печени (n=28), выполняли резекцию70% печени с трансплантации 2,5 млн аллогенных ММСК КМ в НПВ нафизиологическом растворе 0,5 мл.
Животных 4 (F) и 5 (G) групп по 7 крысвыводили из эксперимента на 1, 2, 4, 14 сутки эксперимента, измеряли массукрысы, печени, выполняли забор проб крови, печени с целью проведениядальнейшего исследования.Таблица №2Второй этап исследованияГрупп № Количеств Объем Трансплантацаорезекци ия аллогенныхживотныхиММСК КМпечениС1790%-D27E37F428G5283 этап (табл.ОценкаЛетальность ипродолжительность жизни90%+Летальность ипродолжительность жизниБезМасса крысы,резекципечени, б/хикрови,коагулограмма70%Масса крысы,печени, б/хкрови,коагулограмма70%+Масса крысы,печени, б/хкрови,коагулограмма3) - в данную группу вошли крысы 3 (E), 4 (F) и 5Срокивывода изэкспериментаПослесмертиПослесмерти0 сутки (дооперации)1, 2, 4, 14сутки1, 2, 4, 14сутки(G) группы10из 2 этапа исследования, изучали влияние трансплантации аллогенных ММСК КМна пролиферативную, митотическую активность гепатоцитов и морфометрическиекритерии регенерации паренхимы печени после 70% резекции печени вэксперименте.Таблица №3Третий этап исследованияГруппа№КоличествоживотныхОбъемрезекции печениТрансплантация аллогенныхММСК КМОценкаE17-МорфологияF228Безрезекции70%Срокивывода изэксперимента0 сутки (дооперации)-G32870%+МорфологияМорфология1, 2, 4, 14сутки1, 2, 4, 14суткиПолучение ММСК КМММСК получены из бедренных костей крыс по стандартной методике.Центрифугирование выполняли в течение 7 мин при 300 g.
Содержаниекультуральной среды -DMEMF12 + 10% FBS (BioInd, Индия) + пенициллин 100ед/мл + стрептомицин 100 мкг/мл + L-глютамин 2 мл. В эксперименте использовантретий пассаж клеток. Фенотип ММСК КМ подтвержден при помощи проточнойцитометрии.Время от получения ММСК КМ до введения составляло не более 3 часов.После выполнения резекции паренхимы печени крысам в нижнюю полую венувводили 0,5 мл раствора NaCL 0,9% (B.Braun, Германия) с аллогенными ММСККМ (2,5 млн). Непосредственно перед трансплантацией раствор в колбеперемешивали, набирали в инсулиновый шприц 0,5 мл и вводили в НПВ.Продолжительность введения составляла 3 - 5 минут.Техника операцийРезекция 70% печениРезекция 70% печени у крыс выполнена по методике G.M.
Higgens, R.M.Anderson. Под в/м анестезией раствора Золетила, из расчета 15 мг/кг веса,11выполняли верхнюю срединную лапаротомию длиной 3 - 4 см. Срединную и левуюпереднюю доли печени выводили в рану, долевые сосуды перевязывали уоснования и доли удаляли. Удаленная часть составляла 2/3 (67 – 70%) от общеймассы печени. Лапаротомный разрез ушивали наглухо непрерывным швом.Резекция 85% печениРезекцию 85% печени выполняли по стандартной методике (послевыполнения резекции 70% печени по описанной выше методике, выделялисальниковые доли, правую переднюю долю печени, перевязывали долевые сосудыу основания и доли удаляли.
Лапаротомный разрез ушивали наглухо непрерывнымшвом.Резекция 90% печениРезекцию 90% печени выполняли по стандартной методике под в/м наркозомраствора золетила 15 мг/кг. Выполняли резекцию 70% печени по методикеописанной выше и дополнительно удаляли правую переднюю и правую заднююдоли печени. После 90% резекции печени, в брюшную полость вводили 5% растворглюкозы (из расчета 5% от массы тела), в дальнейшем ежедневно подкожновводили 5% раствора глюкозы (из расчета 5% от массы тела) в течение 7 дней, кпитьевой воде добавляли сахар (для получения 20% раствора глюкозы).Добавление глюкозы при выполнении предельно больших резекций печенинеобходимо с целью исключения смерти животных от гипогликемической комы.Оценка эффективности клеточной терапииИзмерение массы выполнены на весах Ohaus Adventure Pro AV413 (Китай).Массу крысы измеряли до операции и в момент вывода из эксперимента, анализуподвергалась разница.
Массу «регенерированной» печени измеряли в процентах отобщей массы печени по формуле % = A/ (B/0,7), где A = масса печени в моментвывода из эксперимента и B = масса резецированной печени.Определяли концентрацию в крови прямого билирубина, общего белка,альбумина, АЧТВ, МНО, АЛТ, АСТ, ЩФ. Анализ крови выполняли наанализаторах Olympus AU680 (Beckman Coulter, США) и Sysmex Cs-2100i(Япония).12Морфометрический анализ был произведен тремя исследователями спомощью морфометрической окулярной сетки на микроскопе Микмед-5.Гистологический материал фиксировали 4% формальдегидом в течение 24часов, затем заливали в парафин, толщиной 5 мкм срезы депарафинизировали ификсировали, осуществлялась окраска гематоксилином - эозином.Определялисуммарное количество митозов, диаметр ядра, площадь гепатоцитов в пяти поляхзрения при увеличении х400.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
