Диссертация (1139886), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Образцы спермы наносили на предметные стекла с адгезивнымпокрытием «HistoBond» (Германия) и обрабатывали в соответствии стребованиями протокола фирмы-изготовителя «DеadEndTM FluorometricTUNEL System» («Promega», США). Препараты окрашивали с помощьюфлуоресцентногокрасителяDAPI(4,6-диамидин-2-фенилиндол)производства фирмы «Sigma» (США), имеющего выраженную тропность к43ДНК.
При проведении TUNEL-теста указанный краситель, проникая в клеткисперматозоидов с фрагментацией ДНК, взаимодействует со сперматозоидамии окрашивает их оболочку в мерцающий зеленый цвет (рисунок 2).Визуальную оценку осуществляли с помощью микроскопа «Axiovert 200V»(«Carl Zeiss», Германия).Рисунок 2 - Сперматозоиды с фрагментацией ДНК в виде зеленых ядер пометоду TUNELРезультат теста оценивали в виде индекса фрагментации ДНКсперматозоидов, выраженном в процентах. Этот результат означал долюсперматозоидов с поврежденной ДНК от общей популяции сперматозоидов.
Вкачестве порогового значения степени фрагментации ДНК сперматозоидовнами использована величина 15%, рекомендованная как верхняя границанормальных показателей уровня фрагментации ДНК [40].Измерение уровня генерации АФК в эякуляте проводили методомхемилюминесценции с использованием люминометра «LKB-Wallac 1256»(Финляндия). К суспензии клеток добавляли люминол (5-амино-2,3-дигидро1,4-фталазиндион) и оценивали максимальное значение люминисценции,которое наблюдали через 2-10 минут после добавления люминола. Уровень44генерации АФК выражали в мВ/сек, а верхней границей нормы продукцииАФК считали 0,64 мВ/с [45].Трансабдоминальное ультразвуковое исследование (УЗИ) выполнялина аппарате «Logiq 200» («GE MedicalSystems», США) для определениясостояния верхних мочевых путей, мочевого пузыря, предстательнойжелезы и семенных пузырьков, измерения объема остаточной мочи.УЗИ органов мошонки выполняли также на аппарате «Logiq 200» («GEMedical Systems», США) в положении больного на спине в режимах серойшкалы,цветнойиэнергетическойдопплерометрии.Первоначальнооценивали изображение органов мошонки в режиме серой шкалы.
При этомдатчик устанавливали перпендикулярно по отношению к исследуемойобласти и последовательно получали томограммы в поперечной, продольнойи косых плоскостях правой и левой половины мошонки. Выявленныепатологические образования измеряли в поперечном, передне-заднем ипродольном направлениях. При данном исследовании определяли размеры иструктуру яичек, характеристики придатков, оценку окружающих тканейяичка, наличие патологических образований и включений в мошонку и ееорганы, толщину стенок мошонки и количество межоболочечной жидкости.На основании полученных данных определяли объем яичек по следующейформуле: V=(Д×Ш×В)×0,52, где V – объем яичка, см3; Д - верхне-нижнийразмер яичка, см; Ш - толщина яичка, см; В - передне-задний размер яичка,см.
Далее в режиме серой шкалы оценивали состояние вен гроздевидногосплетения. После этого исследовали картину васкуляризации яичек игемодинамики в русле яичковых вен с помощью цветной и энергетическойдопплерометрии.2.4. Методика проведения сеансов гипербарической оксигенации идальнейшей тактики ведения пациентовУ основной группы пациентов процедуру ГБО выполняли в отделенииГБО городской клинической больницы им. С.П. Боткина Департамента45здравоохранения города Москвы (заведующий отделением – кандидатмедицинских наук, доцент Митрохин А.А.). Лечение проводили на аппаратахзавода медицинской техники и товаров народного потребления Федеральногогосударственного унитарного предприятия «Государственный космическийнаучно-производственный центр им. М.В.
Хруничева» (ФГУП «ГКНПЦ им.М.В. Хруничева») – барокамере БЛКС-303 (рисунок 3).Рисунок 3 - Барокамера БЛКС-303Для работы данной барокамеры использовали медицинский кислород.Сеансы проводили ежедневно (с понедельника по пятницу, суббота ивоскресенье - выходные, затем повторно с понедельника по пятницу, всего десять сеансов). Общее время одного сеанса составляло 60 минут:компрессия - 5-10 минут, изопрессия - 40 минут, декомпрессия - 10 минут.При этом давление кислорода составляло 1,2 АТА (в режиме изопрессии).Через 3 месяца после 10 сеансов ГБО у пациентов основной группы ичерез 3 месяца с момента первичного обследования у пациентов контрольнойгрупп проводили контрольное исследование спермы – оценку показателейспермограммы, уровней фрагментации ДНК сперматозоидов и АФК в сперме.462.5.
Экстракорпоральное оплодотворение и характеристика женщин –половых партнеров мужчин с бесплодиемПроцедуру ЭКО у половых партнерш указанной выборки мужчин сбесплодием выполняли на базе отделения репродуктологии (руководительотделения - доктор медицинских наук, профессор Краснопольская К.В.)государственного бюджетного учреждения здравоохранения Московскойобласти«Московскийобластнойнаучно-исследовательскийинститутакушерства и гинекологии» (ГБУЗ МО МОНИИАГ).При подготовке и проведении ЭКО руководствовались требованиямиПриказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 26февраля 2003 года № 67 «О применении вспомогательных репродуктивныхтехнологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия» (действовал до22.04.2013 г.) и Приказа Министерства здравоохранения РоссийскойФедерации от 30 августа 2012 года № 107н «О порядке использованиявспомогательныхрепродуктивныхтехнологий,противопоказанияхиограничениях к их применению».
При этом овариальную стимуляцию,трансвагинальную пункцию яичников и забор ооцитов, обработку эякулята вспециальных сертифицированных средах, оплодотворение in vitro, переносэмбрионов и ведение посттрансферного периода выполняли по стандартнымобщепринятым методикам, подробное описание которых приведено всоответствующих руководствах по акушерству и гинекологии.Диагностику беременности проводили на основании определенияконцентрации β-субъединицы хорионического гонадотропина в сывороткекрови через 14 дней после переноса эмбрионов в полость матки. Тест набеременность считали положительным при уровне данного гормона более 30МЕ/л(биохимическаябеременность).Ультразвуковуюдиагностикуклинической беременности проводили через 21 день после переносаэмбрионов с целью оценки наличия одного или двух плодных яиц в полостиматки.Дляопределениясердцебиенияэмбрионаультразвуковое47сканирование выполняли на 31 день после переноса эмбрионов в полостьматки.Половые партнерши указанной группы мужчин не имели какого-либогинекологического или соматического заболевания, являющегося возможнойпричиной женского бесплодия.
Это служило в нашем исследованиикритерием исключения для женщин, являющихся половыми партнерамиданнойкогортымужчинсбесплодием.Такимобразом,быламинимизирована вероятность влияния женского фактора на развитиебесплодия. Клиническая характеристика женщин приведена в таблице 2.Таблица 2 - Характеристика женщин, подвергнутых процедуре ЭКООсновнаяПоказательКонтрольнаягруппа (n=60) группа (n=30)медиана [нижний квартиль-pверхний квартиль]Возраст, годыИМТ, кг/м2Длительность бесплодия принастоящих сексуальныхотношениях, годыФСГ, мЕд/млЛГ, мЕд/млЭстрадиол, пмоль/лПролактин, мЕд/мл29 [25-34]28 [24-33]22,622,1[20,3-24,3][20,1-24,0]22[2-3][2-3]6,677,23[6,41-6,93][6,92-7,41]4,684,90[4,36-4,99]110,8[4,61-5,22]115,2[106,8-118,1]327,8[110,1-121,3]329,1[304,9-359,6][306,0-359,9]>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,05>0,054824,125,8[20,7-28,8]1,54[20,9-30,1]1,59Прогестерон, нмоль/лАнтимюллеров гормон, нг/мл>0,05[1,37-1,68][1,39-1,73]Доля лиц с наличиемБеременность в анамнезеИскусственное прерываниебеременности в анамнезеСамопроизвольное прерываниебеременностиРоды в анамнезе>0,05pуказанного признака40,0% (24/60) 36,7% (11/30)>0,0528,3% (17/60)26,7% (8/30)>0,0515,0% (9/60)13,3% (4/30)>0,0516,7% (10/60)13,3% (4/30)>0,05Таким образом, сравниваемые группы женщин не имели статистическизначимых различий по всем критериям.
Это означает, что оценкаэффективностипредложенногоподходакповышениюмужскойфертильности проводилась в идентичных для обеих категорий мужчинклинических условиях.2.6. Методы статистической обработки результатов исследованияСтатистическая обработка полученных в результате исследованияданных выполнена с помощью пакета прикладных программ «Statistica v.17.0» («StatSoft», США).
При выполнении всех приведенных статистическихпроцедурисходилиизрекомендацийотечественныхизарубежныхруководств по статистической обработке медицинских данных [25; 50]. Припроведении статистического исследования все наблюдаемые переменныебыли классифицированы как количественные и качественные.Количественные признаки были представлены непрерывными идискретными данными. При их описании на первом этапе проводили анализсоответствиявидараспределенияпризнаказаконунормальногораспределения с использованием статистического теста Шапиро-Уилка. Для49этого использовали проверку статистических гипотез о виде распределенияпризнака. По результатам анализа принимали одну из гипотез: нулевуюгипотезу (распределение исследуемого признака в генеральной совокупностисоответствует закону нормального распределения) или альтернативнуюгипотезу (распределение исследуемого признака в генеральной совокупностине соответствует закону нормального распределения).Дляописанияраспределенияколичественныхпризнаковвпредставленных выборках пациентов, которое отличалось от нормального,указывали следующие характеристики: число объектов исследования (n),медиану (Me), нижний (Q25%) и верхний (Q75%) квартили.
В случаенормального распределения признака для его описания использовали среднеезначение (M) и среднее квадратическое отклонение (SD). При обоихвариантах распределения признака дополнительно указывали минимальное(Min) и максимальное (Max) значения признака.Сравнениегрупппациентовпоколичественнымпризнакам,распределение которых отличается от нормального вида, производили сиспользованием непараметрического метода - U-критерия Манна-Уитни. Принормальном распределении количественного признака сравнение групппациентов проводили с использованием параметрического метода - tкритерияСтьюдента.Приграфическомпредставлениирезультатовсравнения групп с помощью t-критерия Стьюдента, помимо M и SD,указывали еще величину стандартной ошибки среднего значения (SE).Качественныепризнакибылипредставленыноминальнымиипорядковыми данными. Описание качественных данных выполняли путемвычисления абсолютных и относительных частот (процентов) признаков.Сравнение двух групп по качественному признаку проводилось с помощьюкритерия χ2 с определением 95% доверительного интервала (ДИ) дляотносительных частот.Корреляцию между различными признаками спермы оценивали спомощью метода Спирмена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
