Диссертация (1139886), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Поповой и соавт.продемонстрированфрагментацииположительныйДНКсперматозоидовэффектпонового[39] былснижениюпрепаратауровнянаосноведокозагексаеновой кислоты (БрудиПлюс), относящейся к наиболее ценнымдля здоровья человека полиненасыщенным жирным кислотам омега-3.Помимо вышеуказанных лечебных опций, к снижению уровняфрагментации ДНК сперматозоидов могут привести и другие мероприятия,направленные, прежде всего, на изменение образа и устранение факторовриска повреждений ДНК.
Во-первых, это борьба с такими факторами риска,как курение, алкоголь, переедание, ожирение, малоактивный образ жизни,перегревание, действие пестицидов и выхлопных газов. Во-вторых, это болеечастая половая жизнь, так как степень фрагментации ДНК сперматозоидовпропорционально увеличивается сроку полового воздержания. В-третьих, этолечение потенциально устранимых заболеваний, приводящих к повышеннойфрагментации ДНК: варикоцеле, инфекционно-воспалительных процессов,диабета и т.д.
[12; 14; 17; 36; 168; 185; 211; 220; 231].Перспективнымметодомлеченияидиопатическогомужскогобесплодия, ассоциированного с фрагментацией ДНК сперматозоидов,представляется ГБО.Предпосылками для использования ГБО с этой целью могут бытьпризнаныследующиееефизиологическиеэффекты:гипероксическаявазоконстрикция, способствующая разрешению отека тканей вследствиеуменьшениякапиллярнойтранссудации;восстановлениенормальноговазомоторного тонуса сосудов; улучшение местного метаболического статуса;повышение эффекта фибринолиза; формирование адаптивной защиты против35повреждений ДНК после первого сеанса ГБО; терапевтический эффект лечениясиндромаишемии-реперфузии,которыйассоциируетсяспродукциейсвободных радикалов [16].В результате воздействия ГБО на ткань яичка возможно снижение илиустранениехроническойишемии,гипоксииидругихразличныхмикроциркуляторных дисфункций, тем самым препятствуя повышеннойпродукции АФК.
Этот фактор, в свою очередь, способствует улучшениювсех показателей спермы, в том числе и снижению уровня фрагментации ДНКсперматозоидов.В литературе представлены примеры положительного влияния ГБО наразличные параметры спермы. Так, исследование A. Mitrović et al. [161]подтвердило улучшение подвижности сперматозоидов после примененияГБО. По данным, R.Q. Zheng et al. [238], после варикоцелэктомии всочетании с ГБО показатели качества спермы, пенетрационных способностейсперматозоидов и частоты наступления беременности у партнерш былилучше, чем после одной варикоцелэктомии без ГБО. По мнению Д.Г.Коренькова [23], ГБО в сочетании с антиоксидантами успешно может бытьиспользована у мужчин с аутоиммунным бесплодием, когда сохраняетсянизкоесодержаниеантиспермальныхтестостеронаантителэкстра-вкровиипослесниженияинтракорпоральнымиуровняметодамигемокоррекции.Однако, несмотря на положительный эффект ГБО на различныесвойства спермы, мировая литература не содержит каких-либо сведений обисследованиях, направленных на изучение взаимосвязи ГБО и фрагментацииДНК сперматозоидов.
С учетом этого обстоятельства, а также отсутствияконсенсуса среди специалистов относительно тактики лечения фрагментацииДНК сперматозоидов и важной роли данного фактора в развитии мужскогобесплодия настоящее исследование представляется крайне актуальным ипризвано восполнить существующий пробел в указанной научной сфере.36ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Характеристика экспериментальной части исследованияНастоящее исследование состояло из двух частей: экспериментальнойи клинической. Экспериментальная часть исследования представляла собойизучение влияния ГБО на различные структуры ткани яичка животных. Вкачестве экспериментальной модели животных использованы самцы крысинбредной линии Wistar-Kyoto в возрасте 15-20 недель. Животныхсодержали в условиях вивария, и они получали воду и сбалансированныйкорм без ограничения.Животные были подразделены на две группы:1) основная группа (10 животных), у которой проводили 10 сеансов ГБО спомощьюбарокамерыБЛКС-303пометодике,описаннойвсоответствующем разделе данной главы;2) контрольная группа (5 животных), у которой сеансы ГБО непроводили.Электронно-микроскопическоеигистологическоеисследованиесеменников животных основной группы проводили через 2 дня (у пятиживотных) и через месяц (у пяти животных) после 10 сеансов ГБО, а также увсех животных контрольной группы.Для получения материала ткани семенников крыс под эфирнымнаркозом выполняли двухстороннюю орхэктомию по стандартной методикес использованием хирургического инструментария, показанного в рисунке 1.Животных выводили из эксперимента с использованием методов эвтаназии всоответствии с требованиями руководящих документов.37Рисунок 1 - Хирургический набор для выполнения орхэктомии у крысДляпроведенияэлектронно-микроскопическогоисследованиявырезали кусочки ткани яичка размером приблизительно 1 мм3, фиксировалив 2,5% растворе глутарового альдегида и 1% растворе четырехокиси осмия.Затем материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50, 70,96 и 100%), после чего пропитывали в смеси окись пропилена - аралдитоваясмола.
После пропитки материал помещали в капсулы и заливалиаралдитовой смолой, затем помещали в термостат при температуре 60оС надвое суток. Из полученных блоков готовили полутонкие срезы толщиной 1,52 мкм. После этого срезы окрашивали толуидиновым синим. Послепредварительного светомикроскопического исследования полутонких срезоввырезалипирамидкистакимрасчетом,чтобыповерхностьсрезаприходилась на интересующий нас участок.
Ультратонкие срезы толщиной100-200 нм получали на ультрамикротоме фирмы «LKB» (Швеция).Ультраструктурноеизучениепрепаратовпроводилиприпомощиэлектронного микроскопа «JEOL JEM 100-CX» (Япония) в трансмиссионномрежиме при ускоряющем напряжении 80КВ.Для гистологического исследования образцы тканей семенников крысфиксировали в растворе 10% нейтрального забуференного формалина,38проводили по батарее спиртов восходящей концентрации и заливали впарафин по стандартной методике.
Из парафиновых блоков готовили срезытолщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином-эозином. Затем насветооптическом уровне изучали морфологические особенности строениясеменных желез.2.2. Общая характеристика пациентовКлиническая часть исследования основана на материалах обследованияи лечения 90 мужчин с идиопатическим бесплодием, ассоциированным сповышенным уровнем фрагментации ДНК сперматозоидов. Из них 60человек составляли основную группу, которой с 2012 по 2013 гг. на базегородскойклиническойбольницыим.С.П.БоткинаДепартаментаздравоохранения города Москвы (главный врач – доктор медицинских наук,профессор Шабунин А.В.) проводили курсы лечения с помощью ГБО довыполнения процедуры ЭКО. Остальные 30 человек представляли собойконтрольную группу, которой перед выполнением ЭКО сеансы ГБО непроводили.Возраст пациентов варьировал от 25 до 37 лет, а его медиана составила30,5 лет.
Продолжительность срока мужского бесплодия в исследуемойвыборке колебалась от 1 года до 5 лет и составила в среднем 2,4 года.Критериями включения пациентов в исследование служили:- бесплодие в течение 1 года и более;- возраст 18-39 лет;- индекс фрагментации ДНК сперматозоидов > 15%.Критериями исключения служили:- прием препаратов, влияющих на качество эякулята, в течение 6 последнихмесяцев перед началом исследования;- перенесенные хирургические вмешательства на органах малого таза;- травма органов малого таза;- предшествующая лучевая, химиотерапия или термотерапия органов39малого таза;- рецидивирующая мочевая инфекция (хронический уретрит, простатит,везикулит, орхоэпидидимит, цистит, пиелонефрит);- варикоцеле;- гидроцеле;- врожденные аномалии органов репродуктивной системы;- паховая/пахово-мошоночная грыжа;- любые онкологические заболевания;- значимые кардио- или церебро-васкулярные нарушения;- психические заболевания и поражения центральной нервной системы;- боязнь замкнутого пространства;- диабетическая нейропатия;- другие угрожающие жизни состояния;- индекс массы тела (ИМТ) < 18,5 кг/м2 и > 29,9 кг/м2.2.3.
Методы обследования пациентовСтандартное обследование пациентов включало следующие методыдиагностики: изучение жалоб и анамнеза заболевания, физикальноеобследование, лабораторные исследования, УЗИ органов малого таза имошонки с допплерометрией сосудов семенного канатика.При изучении жалоб и анамнеза заболевания основное вниманиеуделяли выявлению возможных причин, влияющих на возникновениемужского бесплодия, для исключения таких пациентов из данногоисследования с целью дальнейшего проведения им патогенетическиобоснованного лечения. Кроме того, выясняли наличие всех факторов,которые могли быть отнесены к категории критериев исключения изнастоящего исследования.Физикальноеобследованиепредполагалооценкуобщегосоматического статуса и состояния органов мочеполовой системы пациента.В перечень обязательного диагностического обследования входили:40- измерение окружности талии;- расчет ИМТ по формуле: ИМТ=m/h2 (m - масса тела в килограммах, h рост в метрах);- оценка характера лобкового оволосения;- определение состояния грудных желез;- оценка состояния кожных покровов;- оценка размеров, консистенции и нарушений развития полового члена;- определение размеров, консистенции и расположения яичек, ихпридатков и семявыносящих протоков;- пальцевое ректальное исследование предстательной железы.Лабораторная диагностика включала в себя общеклинические (общийанализ мочи; бактериологическое исследование мочи с определениемчувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам;общеклинический и биохимический анализ крови; исследование показателейсвертывающей системы крови; исследование группы крови и резуспринадлежности; исследование крови на маркеры гепатитов, наличиеантител к вирусу иммунодефицита человека 1 и2 типов, антител квозбудителю сифилиса) и специальные (оценка гормонального статуса иразличных показателей спермы) методы исследования.Лабораторнаяоценкагормональногостатусаподразумевалаисследование следующих гормонов, влияющих на мужскую репродуктивнуюсистему:1) общего тестостерона;2) глобулина, связывающего половые гормоны (ГСПГ), для расчетасвободного тестостерона;3) лютеинизирующего гормона (ЛГ);4) ФСГ;5) пролактина;6) тиреотропного гормона (ТТГ).В качестве референсных значений указанных гормонов принимали41следующие показатели:1) для общего тестостерона - 12-33 нмоль/л;2) для ГСПГ – 13-71 нмоль/л;3) для ФСГ - 0,95-11,95 мЕд/мл;4) для ЛГ - 1,14-8,75 мЕд/мл;5) для пролактина – 73-407 мЕд/мл;6) для ТТГ – 0,4-4,0 мЕд/л.Расчет уровня свободного тестостерона проводили на основанииданных концентраций общего тестостерона и ГСПГ с использованиемномограммы Вермюлена [22].
Референсными значениями уровня свободноготестостерона считали показатели в диапазоне 45-420 пг/мл.Исследование спермы проводили по следующим направлениям: оценкаспермограммы, определение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов иизмерение уровня АФК в сперме.При исследовании спермограммы эякулят собирали путем мастурбациипосле полового воздержания в течение 2-3 суток. Полученный нативныйпрепарат исследовали в два этапа. На первом этапе оценивали концентрацию,подвижность, агрегация и агглютинация сперматозоидов, а также наличиедругихклеточныхэлементов.Навторомэтапепроводилиоценкуморфологических характеристик и жизнеспособность сперматозоидов. Увсех пациентов исследование спермограммы выполняли не менее двух раз синтервалом в две недели.Основныепараметрыэякулятаоцениваливсоответствиистребованиями руководства ВОЗ 5-го издания от 2010 года [230],приведенными в таблице 1.42Таблица 1 - Нижняя граница нормы показателей эякулята согласноруководству ВОЗ 5-го издания от 2010 года [230]ПараметрЗначениеОбъем эякулята, мл1,5Общее количество сперматозоидов (106 в эякуляте)39Концентрация сперматозоидов (106 в мл)15Подвижность сперматозоидов – поступательные +непоступательные движения,%Сперматозоиды с поступательным движением, %4032Жизнеспособность (количество живых сперматозоидов), %58Морфология (нормальные формы), %4Другие пороговые значения, определенные консенсусомрН>7,2Пероксидаза-позитивные лейкоциты (106 в мл)<1МАR-тест (подвижные сперматозоиды, покрытые антителами, %)<50Тест на иммуногенность подвижных сперматозоидов с<50адгезированными частицами, %Содержание цинка в эякуляте, нмоль/эякулят≥2,4Содержание фруктозы в эякуляте, нмоль/эякулят≥13Содержание нейтральной α-глюкозидазы в эякуляте, мЕД/эякулят≥20Фрагментацию ДНК определяли с помощью метода TUNEL на мазкахэякулята.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
