Диссертация (1139886), страница 5
Текст из файла (страница 5)
[106; 189;202; 203; 206].Метод TUNEL относится к прямым количественным способамопределения разрывов ДНК и основан на связывании 3’-OH концевого24фрагмента, образовавшегося при разрыве ДНК, с мечеными молекуламидезоксиуридинатрифосфатаподдезоксинуклеотидтрансферазы.действиемферментаИнтенсивностьтерминальнойлюминесценциипропорциональна числу встроенных молекул дезоксиуридина трифосфата исоответственно числу разрывов в ДНК.
Детектирование разрывов ДНКпроизводят с помощью световой или флуоресцентной микроскопии, а такжепроточной цитометрии. Для проведения исследования достаточно небольшоечисло сперматозоидов (~ 200). Результат теста оценивают в процентахTUNEL-позитивных клеток от общей популяции клеток. Кроме описанногостандартного варианта, применяют еще его модификации, например, сиспользованием антифлюоресцеиновых антител [27; 125; 199].Метод ISNT аналогичен анализу TUNEL тем, что он также используетколичественную оценку включения дезоксиуридина трифосфата в разрывыДНК.
Однако, в отличие от TUNEL, который позволяет идентифицироватьодно-идвухцепочечныеразрывыДНК,ISNTопределяеттолькоодноцепочечные разрывы, перерывы ДНК через реакцию, катализируемойДНК-полимеразой I. Тест относительно прост для выполнения, но значимоуступает по чувствительности другим видам анализов [116; 199; 202].Метод ДНК-комет (гель-электрофорез единичных клеток) являетсячувствительным и быстрым способом прямой количественной оценкиповреждений ДНК в единичных сперматозоидах. При этом методедеконденсированные сперматозоиды суспендируют в агарозном геле.
Затеммолекулы ДНК разделяют электрофорезом, а треки ДНК визуализируютпосредством окрашивания флуоресцентным красителем. При наличиифрагментов ДНК, не связанных с клеткой, под воздействием электрическогополя они как низкомолекулярные субстанции вытягиваются по направлениюк аноду, что и придает наблюдаемым объектам характерный вид «хвостакометы». Неповрежденные сегменты ДНК с высокой молекулярной массойне мигрируют к аноду и остаются в «голове кометы». Рассчитанные значениядлины и интенсивности флуоресценции «хвоста кометы» используют в25качестве показателей, характеризующих степень повреждений ДНК всперматозоидах [188; 190; 209].Другим электрофоретическим методом оценки фрагментации ДНКявляется тест оценки «лестницы» ДНК.
В отличие от метода ДНК-комет,указанный анализ позволяет идентифицировать нормальные и поврежденныеучастки ДНК сперматозоидов только в образцах с большим количествомклеток [106; 146; 235].Метод SCSA относится к одним из наиболее распространенныхметодов исследования повреждения ДНК. Тест основан на том, что ДНК всперматозоидах с аномальным строением хроматина более склонна кденатурации при кислотной среде или высоких температурах. Используяметахроматические свойства акридинового оранжевого, SCSA измеряетвосприимчивость ДНК сперматозоидов к индуцированной низкой pH(кислотнойсредой)денатурации.Количественнаямераоценкиметахроматического сдвига флуоресценции акридинового оранжевого сзеленого (нативная ДНК) к красному (денатурированная ДНК) с помощьюпроточной цитометрии представляет собой степень денатурации ДНК, т.е.процентсперматозоидовсвысокойчувствительностьюкрН-индуцированной денатурации.
Степень денатурации ДНК в литературе частообозначают как индекс фрагментации ДНК. Кроме этого, SCSA ещепозволяет идентифицировать процент сперматозоидов с незрелым ядром,имеющим аномальную структуру хроматина [83; 104; 171].Метод окраски акридиновым оранжевым основана на аналогичныхпринципахметахроматическую сдвигафлуоресценциис зеленого ккрасному, что и при SCSA. Однако данный метод проще и дешевле, чемSCSA, так как он выполняется путем визуальной интерпретации данных сиспользованием флуоресцентной микроскопии без проточной цитометрииили участия квалифицированного специалиста по SCSA. Тем не менее,проблемынечеткихцветов,быстрогозатуханияигетерогенногоокрашивания вызывают трудности при визуальной оценке результатов, что26снижает диагностические возможности метода [124; 187; 227].Толуидиновый синий является основным красителем, использующимсядля оценки целостности хроматина сперматозоидов.
Фосфатные группы ДНКсперматозоидов в ядрах с неплотно упакованным хроматином и/илинарушением целостности ДНК более склонны к связыванию с основнымикрасителями такими, как толуидиновый синий. Когда краска связывается сгистонами, она приобретает интенсивный синий цвет, в то время как привзаимодействии с протаминами хроматина - бледно-голубой цвет.
Такимобразом, при световой микроскопии сперматозоиды с поврежденной ДНКокрашены в синий цвет, а сперматозоиды без повреждений остаютсябесцветными. Следует отметить, что промежуточные варианты окрашиванияприводят к вариабельности данных и погрешностям при интерпретации. Дляоценки результатов используется также проточная цитометрия. Результатыметода окраски толуидиновым синим, в основном, согласуются с SCSA иTUNEL [101; 142; 158].Анилиновый синий является кислотным красителем, обладающимбольшой тропностью к белкам в поврежденном хроматине сперматозоидов.Это связано с наличием остаточных гистонов и увеличением доступностиосновных групп нуклеопротеида.
Нарастание окрашивания сперматозоидованилиновымсинимслужитподтверждением нарушенияцелостностихроматина. Методика является простой, недорогой и осуществляется сиспользованием только световой микроскопии. Хотя результаты данногометода коррелируют с данными метода окраски акридиновым оранжевым,гетерогенность окрашивания остается существенным его недостатком [177;198; 201].ХромомицинА3являетсяфлуоресцентнымкрасителем,специфическим для гуанин-цитозин-богатых последовательностей ДНК.Хромомицин А3 взаимодействует с ДНК именно в том месте, в которомпротамин связывается с ДНК.
Степень окрашивания сперматозоидов имеетобратную связь со степенью протаминации зрелого сперматозоидов. Поэтому27большая интенсивность окраски хромомицином А3 указывает на дефицитпротамина или аномальную упаковку хроматина. Этот метод являетсянедорогим и простым, и для него требуется наличие флуоресцентногомикроскопа.Субъективностьвинтерпретацииполученныхданныхвыступает важным ограничением методики [87; 129; 130].Тест SCD основан на дисперсии хроматина вокруг ядра, за счет чегоможно различить сперматозоиды с различной степенью фрагментации ДНК.После индуцированной конденсации при отсутствии фрагментации ДНКсперматозоиды дисперсия хроматина образует большое поле, наличиифрагментации - поле дисперсии имеет небольшие размеры или вообщеотсутствует.
Результаты оценивают путем световой или флуоресцентноймикроскопиипослеобработкисперматозоидовсоответствующимикрасителями [73; 118; 182].Метод FISH использует гибридизацию флуоресцентно меченых ДНКпроб на цитогенетическом препарате и позволяет обнаружить любые участкиповреждений ДНК в образце генома. Проведение такого анализа требуетсинтеза пробы (зонда), комплементарного интересующему нас участку ДНК.Меченая проба и ДНК-матрица подвергаются денатурации, после этогопроба по принципу комплементарности присоединяется к соответствующемуучастку ДНК.
Технология была успешно использована для оценки уровняфрагментации ДНК в образцах спермы, но она в настоящее время находитсяна стадии экспериментального изучения, и окончательные выводы по еепрактическому применению все еще не получены [18; 42; 107; 108; 176].Как было указано, для большинства тестов необходимо индуцированиеденатурации ДНК для обнаружения разрывов в ДНК.
Это означает, чтоданныеметодысперматозоидов,оцениваютипоэтомупотенциальныеониобладаютповрежденияотносительноДНКнизкойпрогностической ценностью. В отличие от них TUNEL, ISNT и метод ДНКкомет не требуют денатурации ДНК и измеряют реальную поломку ДНК.Несмотря на достаточно большое число исследований в данной28области, к настоящему времени не существует единых подходов к выборуметода диагностики фрагментации ДНК сперматозоидов, интерпретациирезультатов исследования, оценке взаимосвязи этого показателя и различныхаспектов фертильности, в том числе частоты наступления беременности вестественных условиях или с помощью ВРТ.
Такие обстоятельства приводятк противоречивости результатов различных исследований и невозможностиих сопоставления между собой. Однако необходимо отметить, что вбольшинствеисследованийктяжелойстепенифрагментацииДНКсперматозоидов отнесено значение индекса фрагментации > 30% [32; 40; 82;86; 100; 103; 105; 115; 134; 147; 172; 212].1.4. Методы лечения фрагментации ДНК сперматозоидовСуществующиесперматозоидовподходывысокойкстепенипреодолениюможнофрагментацииподразделитьДНКусловнонагенетические и андрологические (лечебные) методы.Генетические методы представляют собой процедуры, направленныена репарацию фрагментации ДНК сперматозоидов на различных стадияхспермато- и эмбриогенеза, и основными из них являются следующиемеханизмы: репарация путем удаления поврежденных нуклеотид ДНК;репарация путем удаления поврежденных азотистых оснований ДНК;исправление ошибочно встроенных неповрежденных оснований (mismatchрепарация);пострепликативнаярепарацияДНКирепарациядвухцепочечного разрыва ДНК.
В настоящее время мировая литературанасчитывает относительно небольшое число публикаций, посвященныхизучениюмеханизмоврепарацииДНКзародышевыхклетокумлекопитающих. Большинство таких работ сосредоточено на исследованииклеток других типов. Поэтому аналогичные исследования в области мужскихзародышевых клеток в настоящее время носят экспериментальный характер,и их результаты не могут быть рекомендованы к клиническому применению[60; 79; 85; 116; 165; 194].29Лечебные мероприятия, применяемые в андрологической практике примужском бесплодии, связанном с повышенной фрагментацией ДНКсперматозоидов, включают следующие методы.Одним из методов лечения фрагментации ДНК сперматозоидовявляется обработка (отмывание) эякулята, за счет чего добиваютсяэлиминации неживых и апоптотических сперматозоидов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
