Диссертация (1139785), страница 13
Текст из файла (страница 13)
№ 10 148 334 001 (Германия), содержаниерассчитывали в г/л;5.активностьCYP3A4гидроксикортизолакпоотношениюконцентрацииконцентрациикортизола6-ß(6-ß-гидроксикортизол/кортизол) в утренней порции мочи;Через 7 дней после добавления этилметилгидроксипиридина малата(Этоксидола) в дозе 100 мг/сутки (внутривенное введение) к стандартнойтерапии во второй подгруппе каждой группы и продолжения стандартнойтерапии в первой подгруппе каждой группы мы повторно исследоваливышеперечисленные показатели.692.2 Методы исследования2.2.1.Методика исследования концентрации альдостерона в крови методомжидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием(LC-MS/MS)Так как альдостерон является потенциальным маркерным субстратомактивности ферментов системы Р450, в частности изофермента CYP3A4, мыисследоваликонцентрациюальдостеронавкровиметодомжидкостнойхроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.Для проведения этой пробы мы производили забор 5 мл крови в сухиегепаринизированные пробирки из периферической вены утром в положении сидя(пациенты находились в этом положении не менее 2-х часов), строго натощак(между последним приемом пищи проходило не менее 8 часов).
За день до сдачикровипациентыцентрифугированияограничивалиотделялиприемплазмуотжирнойклеток.пищи.ПробиркуПосредствомсплазмойзамораживали.Алгоритм подготовки проб: разморозить образцы плазмы при комнатнойтемпературе; добавить к 5 мл плазмы 5 мл ацетонитрила; в течение 10 минутвстряхивать на вортексе; центрифугировать в течение 10 минут при 13200 об/мин;органический слой фильтровать через фильтр-насадку на шприц с диаметром пор0,45 мкм в микропробирки; полученные микропробирки с фильтратом поместитьв автосемплер хроматографаАнализ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu UFLC стандемным масс-спектрометром Shimadzu LCMS-8040.
Состав подвижной фазы:ацетонитрил/0,1% раствор муравьиной кислоты в воде в соотношении – 75% иацетонитрил25%. В хроматограф вводилось 15мклаликвоты при скорости потокаподвижной фазы – 0,5 мл/мин. Обращенно-фазовая колонка Zorbax Eclipce XDBC18, 5 мкм (150х4,6 мм), температура колонки 30˚С. Время хроматографированиясоставило 0,5 мин в условиях МС-детектирования в позитивной полярности врежиме MRM.
Основной ион - 359,2 m/z,энергия соударения - 24 В.702.2.2. Исследование уровня парциального давления в крови кислорода(PaO 2 ), углекислого газа (PaCO 2 ), насыщения кислородом гемоглобина вэритроцитах (сатурация – SaO 2 )Уровень парциального давления в крови кислорода (PaO 2 ), углекислого газа(PaCO 2 ) и насыщения кислородом гемоглобина в эритроцитах (сатурация – SaO 2 )мы исследовали на анализаторе газов крови StatProfilepHOxUltra (США).Для проведения этой пробы мы производили забор 5мл крови в сухиегепаринизированные (концентрацией гепарина в пределах 20-25 МЕ/мл) пробиркииз пальца утром натощак. Образец крови тщательно перемешивали.
В течение 15минут с момента забора крови пробирку помещали в газовый анализатор.2.2.3. Исследование уровня 2,3-ДФГ в кровиВфункциональнойсистемеорганизмачеловека,дляобеспеченияоптимального уровня кислорода в крови, наряду с гемоглобином, большую рольиграет2,3-дифосфоглицерат(2,3-ДФГ),регулирующийдиссоциациюоксигемоглобина на гемоглобин и кислород в зависимости от парциальногодавления кислорода в легких. В норме у здоровых лиц активность 2,3-ДФГснижена, повышение его концентрации происходит при гипоксии и нарушенияхметаболизма. Уменьшение парциального давления кислорода в крови приводит кповышению уровня лактата в крови, активированию гликолиза, понижению рНсреды, что способствует ускорению синтеза в эритроцитах 2,3-ДФГ и АТФ сповышением их концентрации.
У пациентов с тяжелым течением хроническойсердечной недостаточности такой механизм естественной компенсации нарушен,выработка 2,3-дифосфоглицерата происходит медленно и в недостаточныхколичествах. Определение уровня 2,3-ДФГ в цельной крови производилосьферментным методом с использованием набора реагентов фирмы «Rosh», кат.№10148334001, Германия. Содержание 2,3-ДФГ рассчитывали в г/л цельнойкрови. Исследование выполняла к.б.н. Горошко О.А.Алгоритм подготовки проб:711.Забор крови происходит утром натощак из периферической вены пациента впредварительно обработанную гепарином пробирку, охлаждаемуюльдом.Немедленно выполняется депротеинизация.2.Пипеткой в центрифужную пробирку объёмом 10 мл отмеряем 5 млперхлорной кислоты, приблизительно 0,6 М (охлаждаемой льдом)3.Добавляем 1 мл крови и перемешать.
Необходимо промыть пипетку передповторным наполнением и опорожнением.4.Центрифугируем смесь в пробирке на режиме: 5000 оборотов/минуту втечение 10 минут.5.Берем 4 мл чистого, бесцветного супернатанта (надосадочной жидкости) инейтрализуем с помощью 0,5 мл 2,5 М раствора карбоната калия.6.60 минут держим в ванне со льдом.7.Отделяемосадокперхлоратаприпомощифильтрацииилицентрифугирования в холоде.8.Для пробы используем 0.1 мл супернатанта (надосадочной жидкости).Ферментный метод основан на двух принципах: первый - 2,3-ДФГ -используется как кофактор для реакции с фосфоглицератмутазой (энзиматическоеотщепление фосфора в присутствии фермента фосфоглицератмутазы), второйиспользуется как субстрат в реакции стимуляции фосфогликолевой кислотыбифосфоглицератфосфатазы,вкоторомизмеряетсястепеньисчезновенияфосфоенолпирувата.
Реакция расщепления 2,3-ДФГ происходит под действиемфосфоглюкомутазы (ФГМ), которая активируется гликолят-2-фосфатом, дляполучения фосфоглицерата (ФГ) и фосфат-иона (Р). При этом в смеси можетприсутствовать и 2-фосфоглицерат и 3-фосфоглицерат. Поэтому в первуюочередь проводят реакции 1-5 для удаления этих субстратов, присутствующих вхимической смеси. А затем реакцию расщепления 1,2-дифосфоглицерата.Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при 340 нм и по разностиоптическойплотностиопределяютЕдиничная ошибка определения 5%количествосодержащегося2,3-ДФГ.722.2.4. Методика проведения пробы для оценки активности CYP3A4 посоотношению 6ß-гидроксикортизол/кортизол (6-Б-ГК/кортизол) в мочеАктивностьCYP3A4гидроксикортизол/кортизолмывоценивалимочепосоотношению(6-Б-ГК/кортизол).6ß-6-Б-ГК/кортизолобразуется из кортизола исключительно под действием CYP3A4.
При высокомсоотношении 6-Б-ГК/кортизол наблюдается высокая активность CYP3A4, принизком соотношении, соответственно – низкая.Для проведения этой пробы всю утреннюю порцию мочи мы собирали вотдельную емкость, после чего из нее отбирали порцию мочи – 5 мл - в пробирку,затем пробирку с мочой замораживали. Подготовка проб и определениеконцентраций проводилось по методу, разработанному Смирновым В.В.,Савченко А.Ю., Раменской Г.В. [44]. Алгоритм подготовки проб:1.Разморозить образцы мочи при комнатной температуре;2.Отобрать 2 мл мочи из пробирки.3.Добавить к отобранной моче 4 мл раствора этилацетат/изопропанол вобъемном соотношении 85/15.4.В течение 10 минут встряхивать.5.Центрифугировать в течение 5 минут при скорости 3000 об/мин.6.Отделить органический слой от водного слоя.
К водному слою повторнодобавить эктрагент и повторить пункты 4 и 5. Повторно отделить органическийслой и объединить его с ранее полученным слоем.7.Добавить в объединенный органический слой 2 мл 1М раствора NaOH.8.Встряхивать в течение 10 минут, затем центрифугировать в течение 5 минутпри скорости 3000 об/мин.9.Отделить органический слой.10.В вакуумно-испарительном аппарате упарить органический слой.11.Сухой остаток растворить 1 мл этилового спирта.Концентрация кортизола 6-Б-КГ в моче определялись методом хромато-масс-спектрометрическогоанализанавысокоэффективномжидкостномхроматографе Agilent 1200 LC/MS. Состав подвижной фазы: вода, подкисленная73HCOOH (1 мл муравьиной кислоты на 1000 мл воды) – 55% и ацетонитрил – 45%.В хроматограф вводилось 10 мклаликвоты при скорости потока подвижной фазы– 0,5 мл/мин.
Обращенно-фазовая колонка Waters5 мкм (4,6х150 мм), температураколонки 35˚С. Использовался ультрафиолетовый детектор с длиной волны 246 нм.Масс-детектор работал в режиме сканирования в позитивной полярности.2.2.5. Исследование мозгового натрийуретического пептида (BNP)У всех пациентов забирали кровь из вены предплечья утром натощак вусловиях процедурного кабинета в пробирки BDVacutainer К2ЭДТА/К3ЭДТА.Непосредственно после взятия в цельной крови определяли содержание BNP спомощью панели TriageBNPTest на анализаторе TriageMeter («Biosite»,США).Методика проведения BNP построена на принципе одноразовых картриджей (тестполоски) на которые наносится пипеткой приблизительно 250 мкл цельной кровиили плазмы. Картридж вставляется в специальный порт и через 10-15 минутинкубационного периода, пока происходит иммунная реакция взаимодействиямоно- и поликлональных антител с BNP, на экране высвечивается значение BNP.На основании результатов тестов фирма BiositeDiagnostics, США – разработаласредние значения BNP для каждого ФК ХСН.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
