Диссертация (1139750), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Наосновании результатов каждого из методов, а также по их совокупностибыли поставлены предварительные диагнозы. Затем с того же участка кожи свысыпаниями и с соседнего участка видимо неизмененной кожи (для ИГХ)выполнялосьвзятиебиоптатовибылипроведеныстандартныедиагностические процедуры: гистологическое и иммуногистохимическоеисследование (прямая РИФ).Всем пациентам проводилась клиническая оценка высыпаний сподробным их описанием, а также комплексное обследование, включавшееобщий и биохимический анализ крови, анализ крови на инфекции (сифилис,44ВИЧ, гепатит В и С), общий анализ мочи. При показаниях назначалисьдополнительные исследования, консультации врачей других специальностей(гастроэнтеролог, эндокринолог, оториноларинголог и других).
Был проведентщательный сбор анамнеза с уточнением времени начала и характера течениязаболевания, наследственной отягощенности, сопутствующей патологии.Окончательный диагноз ставился на основании гистологического ииммуногистохимическогоисследований.Впроцессестатистическойобработки полученных результатов была сопоставлена частота выявляемостикаждого морфологического признака, выявленного по отдельности УД иКЛСМ, затем проводилось сопоставление с частотой выявления этихпризнаков классическим гистологическим методом.
На следующем этапесопоставляласьгистологическимдиагностическаяточностьисследованием.И,неинвазивныхнаконец,былиметодовссопоставленыдиагностические возможности изучаемых методов (по отдельности и всовокупности) в сравнении со стандартными методами диагностики —гистологическим и иммуногистохимическим исследованием, на основаниичего были сделаны выводы о возможностях каждого метода в отдельности ипри совместном их применении в диагностике изучаемых АБД.2.3Стандартныеметодыморфологическойдиагностикиаутоиммунных буллезных дерматозовИсследования проводились на базе клиники кожных и венерическихболезней УКБ №2 ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М.
Сеченова, кафедрыпатологической анатомии им. А.И. Струкова Первого МГМУ им. И.М.Сеченова, Кафедры трансплантологии и искусственных органов ПервогоМГМУ им. И.М. Сеченова, Лаборатории патоморфологии и иммунологииНаучно-исследовательского клинического института педиатрии РНИМУ им.Н.И.Пирогова,Лабораториииммуногистохимииотделаклиническойпатологии ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии иискусственных органов имени академика В.И. Шумакова»45Гистологическое исследованиеБыло проведено гистологическое исследование биоптатов кожи всехбольных. У каждого пациента брали 2 образца кожи — с пораженногоучастка (предпочтение отдавалось участкам с буллезными элементами, еслиони были у данного пациента) и с участка видимо не пораженной кожи,расположенного вблизи высыпаний. Второй образец использовался в ходеиммуногистохимического исследования.Эксцизионная биопсия пораженных участков кожи проводилась подместной анестезией 2% раствором новокаина, размер образцов кожи 0,3х0,5см.
Процедура приготовления препарата была стандартной. Материалпомещали в фиксирующую жидкость, затем подготавливали тонкие срезы спомощью микротома и окрашивали гематоксилином и эозином. Готовыесрезы изучали под микроскопом и фотографировали.Иммуногистохимическое исследование (прямая РИФ)Длявыявленияфиксированныхантител(иммуноглобулинов)ииммунных комплексов применяли классический метод [Белецкая Л.В.,ДаниловаТ.А.,1997;иммунофлюоресценции,сBeutnerE.,использованиемChorzelskiIgGиT.P.,C31973]компонентакомплемента (а также IgA, IgM).Серийные криостатные срезы после просушивания (30 мин прикомнатной температуре) промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером для удаления свободных растворимых белков, а затем обрабатывали люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против иммуноглобулинов классов G, М, А и С3-компонента комплемента.
После этого срезы повторно промывали (3-5 мин) и помещали подпокровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Затем полученные образцыанализировали и фотографировали. Для контроля одновременно проводилиизучение срезов, окрашенных гематоксилином и эозином.462.4 Изучаемые неинвазивные методы диагностики аутоиммунныхбуллезных дерматозовНеинвазивные исследования (УД и КЛСМ) были выполнены, а ихрезультаты интерпретированы, лично автором и проводились на базе НИО«Иммунозависимых дерматозов» НОК центра Иммунозависимых дерматозовНИЦ Первый МГМУ им.
И.М. Сеченова и клиники кожных и венерическихболезней УКБ №2 ГБАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова.2.4.1 Ультразвуковое дермасканированиеУльтразвуковоедермасканирование(УД)проводилиметодомдвухмерного ультразвукового сканирования кожи при помощи аппаратаDermascan С Ver.3 («Соrtex Technology», Дания) (Рисунок 1), с частотойультразвуковой волны 20 мГц, проникающей на глубину 7-8 мм.Рисунок 1 — Dermascan С Ver.3 («Соrtex Technology», Дания)Предпочтение отдавалось участкам с буллезными элементами (еслиони были у данного пациента). Ультразвуковые волны отражаются отпрепятствийнаграницахразделасредсразличнойплотностью.Преобразованные в цифровой аналог волны отображаются в виде волн (Арежим) или преобразованных цветовых пикселей (В-режим).При А-режиме отраженный от кожи сигнал можно наблюдать наэкране в виде волны с разной амплитудой, особенно высокой на границе двухсред (внешняя среда/эпидермис и граница дермы/гиподермы).
А-режимпозволяет с точностью измерить расстояние между двумя амплитудамиотраженной волны, что соответствует толщине слоев кожи — эпидермиса и47дермы. В-режим ультразвука соответствует цифровой аналог ультразвуковойволны, отраженной от разных структур кожи, преобразованной в цифровыепиксели с различной интенсивностью свечения. Яркость свечения позволяетсудить об акустической плотности тех или иных структур кожи.
При Врежиме на экране появляется цветное увеличенное изображение участкакожи с неоднородной эхогенностью (яркостью), что соответствует разнице вплотностимеждуструктурамикожи.В-режимпозволяетоценитьструктурные особенности эпидермиса и дермы, получить изображениетканей участка около 1,5 см глубиной 0,7-0,8 см и визуализироватьэпидермис, дерму, подкожно-жировую клетчатку, мышечные волокна ипридатки кожи (волосяные фолликулы, железы и т.д.).С помощью УД оценивалась толщина дермы с эпидермисом,интенсивность эхосигнала эпидермиса и дермы в целом, наличие отдельныхгипо- и гиперэхогенных участков. Кроме этого, ультразвуковые снимкиоценивались по визуальным критериям путем сравнения двух изображений:патологического участка и нормальной кожи (на зеркальном участке телапациента). Результаты УД (видео и изображения) были сохранены вформатах DСL и TIF.С помощью УД был выявлен и оценен перечень специфических инеспецифических ультразвуковых признаков АБД, а также специальныеультразвуковыефеномены,свидетельствующиеонеспецифическихизменениях в эпидермисе и дерме, но не имеющие прямых гистологическиханалогов:степень сниженияобщейэхогенности дермыиналичиесубэпидермальной гипоэхогенной зоны (Subepidermal Low Echogenic Band,SLEB).2.4.2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопияКЛСМ проводилась на аппарате Vivascope 1500 (Lucid Inc, RochesterNY, USA; Mavig GmbH, München, Germany) (Рисунки 2 а, б).482а2бРисунок 2 а, б — а) комплекс Vivascope 1500 (Lucid Inc, Rochester NY,USA; Mavig GmbH, München, Germany); б) устройство контактного датчикаконфокального микроскопа Vivascope 1500.КЛСМ позволяет послойно исследовать структуру тканей in vivo врежиме реального времени с высокой разрешающей способностью,сравнимой с гистологическим исследованием.
Сканирование осуществляетсяс помощью волн длиной 830 нм, мощность не более 16 мВт, что безопаснодля всех участников исследования, поскольку не вызывает повреждениякожи или глаз. Сканирование производится в горизонтальной плоскости,методом последовательной покадровой съемки (Рисунок 3).Рисунок 3 — Сравнение принципов получения изображений пригистологическом исследовании и с помощью конфокального лазерногосканирующего микроскопа49Площадь отдельного кадра 0,5×0,5 мм, общая площадь исследуемогоучастка — 4×4 мм, максимальная глубина, на которой можно получитькачественное изображение составляет 200-400 мкм (в зависимости от свойствисследуемого участка кожи), что является достаточным для изображенияэпидермиса и верхней части дермы (сосочковой и, в некоторых случаях,верхней части ретикулярной). Получение снимков возможно благодаряестественномуконтрастуиразличиямвкоэффициентерефракциикомпонентов кожи, прежде всего, таких как меланин и кератин [120].В области контакта с кожей используется специальное устройство(Рисунок 2 б), позволяющее уменьшить образование артефактов.
Оносодержит специальное иммерсионное масло и гель на границе раздела фаз.Это устройство состоит из металлического и одноразового пластиковогокольца, которое фиксируется непосредственно на коже пациента.ПрипроведенииКЛСМпредпочтениеотдавалосьучасткамсбуллезными элементами (если они были у данного пациента). С помощьюКЛСМ были выявлены и оценены специфические и неспецифические КЛСМпризнакиАБД,аналогичныевыявляемымпригистологическомисследовании. Перечень этих признаков был практически сходен с тем, что ипри выполнении УД, но при КЛСМ в пузыре выявляли акантолитическиеклетки.
Кроме того, были выявлены дополнительные специальные КЛСМпризнаки: наличие воспалительных клеток и фибрина в полости пузыря,воспалительный инфильтрат в эпидермисе, признаки пара- или дискератоза вэпидермисе; признак, не имеющих прямых гистологических аналогов:степень повреждения структуры «медовых сот» (нормальной структурыэпидермиса), если такое повреждение есть.Результаты КЛСМ сохранялись в виде изображений и видеофайлов.Видеодокументирование позволяло наблюдать состояние кожи в динамике, вчастности определять и фиксировать интенсивность кровотока в сосудахдермы.502.4.3 Методика проведения исследования морфологии кожинеинвазивными методамиВ соответствии с целью и задачами был разработан общий дизайнисследования и конкретная методика проведения исследования кожинеинвазивными методами (УД и КЛСМ), состоящая из нескольких этапов.Все полученные данные вносились в протоколы обследования больных, атакже были систематизированы в форме статистических таблиц.1.Для изучения диагностической ценности неинвазивных методовпри разных АБД пациенты дважды были разделены на группы: 1) взависимости от окончательного диагноза – на 4 группы (АП, БП, ПДС, LAD)2) в зависимости от наличия буллезных высыпаний — на 2 группы (сбуллезными элементами и без них); данное решение объясняется тем, чтопри отсутствии буллезных высыпаний гистологическое исследование менееинформативно у пациентов с АБД, это же можно предположить и вотношении изучаемых методов.
Все дальнейшие описания и расчетыпроизводились по указанным группам отдельно и в совокупности.2.На основании данных литературы был сформирован стандартныйперечень специфических и неспецифических для АБД гистологическихпризнаков, которые являются критериями диагноза изучаемых АБД. Напервом этапе исследования было проведено УД и КЛСМ с выявлением иописаниемданногоперечняпризнаковилиихпрямыханалогов.Специфические признаки: наличие пузыря на исследуемом участке кожи, вслучае его обнаружения определяли уровень его расположения (интра- илисубэпидермальный) и наличие в его полости клеточного содержимого (приУД) или акантолитических клеток (при КЛСМ). Неспецифические признаки:наличие инфильтрата и расширенных сосудов дермы.3.Далее была сопоставлена выявляемость гистологическим, УД- иКЛСМ- методами каждого из вышеописанных признаков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
