Э. Рис, М. Стернберг - Введение в молекулярную биологию от клеток к атомам (1128690), страница 16
Текст из файла (страница 16)
При этом обеспечиваютсяне только выгодные вандерваальсовы контакты междуатомами,ноивозникаетдополнительнаястабилизация благодаря перекрыванию -орбиталейатомов контактирующих оснований. Стабилизацияосуществляется также за счет благоприятного гидрофобного эффекта, проявляющегося в том, что неполярные основания защищены от непосредственногоконтакта с растворителем. Напротив, сахарофосфатный остов с его полярными группами и заряженнымиатомами экспонирован, что также стабилизируетструктуру.Полиморфизм ДНК— это способность двойнойспирали принимать различные конформации. Рентгеноструктурные исследования кристаллов полинуклеотидов1 выявили три основных типа структур — А-,В- и Z-формы.
В-ДНК— это стандартная уотсон-криковская структура, в которой плоскости пар оснований перпендикулярны оси двойной спирали. В А-ДНКплоскости пар оснований повернуты примерно на 20°от нормали к оси правой двойной спирали. На витокспирали здесь приходятся 11 пар оснований. А-ДНКобразуется при высушивании волокон В-ДНК. ZДНК — это левая спираль с 12 парами оснований навиток. Буква Z указывает на зигзагообразную формусахарофосфатного остова ДНК в этой форме. Плоскости оснований примерно перпендикулярны оси спирали. В клетке ДНК обычно находится в В-форме, но1Коротких полинуклеотидов, так называемых олигонуклео-тидов. — Прим. ред.отдельные ее участки могут находиться в А-, Z- илидаже в иной конформации1.Определение нуклеотидной последовательностиДНК (секвенирование) теперь не занимает многовремени, и это крупное достижение позволиломолекулярным биологам решить очень важнуюзадачу определения структуры генов (гл.
26—28). Широко применяются два метода секве-нирования:метод химического расщепления Максама и Гилберта иметод обрыва цепи Сэнгера и др. Каждый из нихможетиспользоватьсядлясеквенированияфрагментов ДНК длиной лишь несколько сотен оснований. Поэтому первый этап состоит в расщеплениидлинных цепей (например, целых хромосом) на фрагменты, с которыми можно вести дальнейшую работу.Для этой цели применяют рестрицирующие ферменты.Рестрицирующие ферменты выделены из бактерийи бывают двух типов.
При секвенировании используются только ферменты типа II, которые расщепляют(разрезают) двухцепочечную ДНК в местах со специфической последовательностью оснований, обычноимеющей размер 4—6 пар оснований (гл. 30). Рестрицирующих ферментов очень много, и каждый из нихспецифичен к определенной последовательности оснований. Например, фермент ЕсоR1 из Е. coli разрезает последовательность в местах, обозначенных стрелками:Главная особенность последовательностей оснований, расщепляемых рестрицирующими ферментами,заключается в том, что они, как правило, являютсяпалиндромами: последовательности обеих цепей,прочитываемые от 5'- к З'-концу, оказываются одинаковыми. Такие последовательности обладают осьюсимметрии 2-го порядка, обозначенной на рисункезнаком ♦.В случае метода химического расщепления сначала метят 5`-конец молекулы ДНК радиоактивным'Образование Z-формы, крестообразных и иных структурстимулируется сверхспирализацией ДНК.
— Прим. ред.32РО4 с помощью фермента полинуклеотидкиназы.Затем ДНК обрабатывают соответствующими реагентами, расщепляющими эту цепь около определенных оснований. Такое расщепление проводят входе четырех параллельных реакций в условиях,когда разрыв происходит после А в одной из реакций,после G в другой, после С в третьей и после С и Т вчетвертой. Условия реакций таковы, что получаютсясмеси, содержащие фрагменты всевозможной длины,отсчитываемой от меченого 5'-конца до каждой точкицепи, где находится данное основание.
Например,если G находится в положениях 1, 5, 7 и 19 вофрагменте из 20 оснований, то одна из смесей,полученных в ходе деградации, будет содержать радиоактивные фрагменты длиной 5, 7 и 19 оснований, атакже свободный G. С помощью электрофореза вполиакриламидном геле каждую из четырех смесейразделяют на фрагменты разной длины. Затем гельпомещают на фотопленку, на которой появляетсяпочернение в тех местах, где находился радиоактивный материал (этот процесс называетсярадиоавтографией). Последовательность основанийпрямо считывается с пленки, как это показано, например, на рис.
19.3.Метод обрыва цепи использует другой подход. Оносновывается на синтезе радиоактивно меченнойкомплементарной цепи ДНК с использованием в качестве матрицы нативной ДНК (гл. 20, 21). Синтезосуществляется с помощью фермента ДНК-полимеразы I (гл. 20, 21). В реакционной смеси присутствуютчетыре немеченных дезоксирибонуклеозидтрифосфата, из которых строится комплементарная цепь ДНК.Однако помимо них в системе находится модифицированная форма одного из оснований (его 2'3'-дидезоксианалог), при включении которой рост цепипрекращается.
В результате синтезируются цепочкиДНК всевозможной длины. Используются четыре реакционные смеси, в каждую из которых добавляютпомимо четырех мономеров аналог одного из оснований в качестве терминатора роста цепи. Затем цепи вкаждой смеси разделяют с помощью гель-электрофореза и проводят радиоавтографию. С полученной фотопленки непосредственно считывают последовательность оснований. Метод Сэнгера и др. был развит наоснове более раннего, так называемого плюс-минусметода, в котором также использовался синтез комплементарных цепей ДНК.19. Структура РНКРис.
19.1.Рибонуклеиновые кислоты (РНК) , присутствующие в клетках как про-, так и эукариот, бываюттрех основных типов: информационная (матричная,мРНК), транспортная (тРНК) и рибосомная (рРНК).В ядре клеток эукариот содержится РНК четвертоготипа — гетерогенная ядерная РНК (гяРНК). Унекоторых вирусов РНК служит носителемгенетической информации (гл. 5). мРНК являетсякопией (транскриптом) соответствующей ДНК.
Этоттранскрипт служит матрицей для синтеза белка.Каждые три последовательных основания мРНК(называемые кодоном) детерминируют одинаминокислотный остаток. Молекулы тРНКпереносят специфические аминокислотные остатки копределенному участку мРНК в ходе синтеза белка. Внастоящее время структура тРНК хорошо из-вестна (см. ниже).
Молекулы рРНК встречаются в различных формах и образуют в комплексе с белками рибосому (гл. 24) — сложную органеллу, в которой происходит синтез белка.Сведберг (S)-единица измерения коэффициентаседиментации, являющегося мерой массы макромолекулы (гл. 44). Его находят, измеряя скорость осаждения молекул в центробежном поле. Значения коэффициента седиментации РНК Е. coll приведены втабл. 19.1.Транспортная РНК (тРНК) узнает соответствующийкодон в мРНК и переносит нужную аминокислоту крастущей полипептидной цепи.
Узнавание кодона вмРНК осуществляется с помощью трех последовательных оснований в тРНК, называемых антикодо-Таблица 19.1. Характеристики разных РНК Е. collТип РНКСодержание, %Коэффициент седиментации, SрРНК802365тРНКмРНК15544-26Мол. масса, Мг1 000 000500 00035 00025 00025 000-1000 000Число нуклеотидов300015001007575-3000ном.Аминокислотныйостатокможетприсоединяться к З'-концу молекулы тРНК.Специфичностьтакойсистемыпереносаобеспечивается тем, что имеется по крайнеймере одна тРНК для каждой аминокислоты.
Так,тРНК для Phe обозначается тРНКРЬе.Химическая структура тРНК. Молекула тРНК состоит примерно из 75 нуклеотидов, ковалентносвязанных друг с другом в линейную цепочку смол. массой Мг = 25000 и коэффициентомседиментации 4S. Установлены нуклеотидныепоследовательности многих тРНК; первая из них —для тPHKAla из дрожжей — была определена Холл ив1965г.ВсетРНКначинаютсясфосфорилированного 5'-конца; первым основанием обычно является G. На З'-конце всегдаприсутствуют три основания — ССА и концевая З'гидроксильная (—ОН) группа. СоставляющимитРНК являются не только четыре обычныхоснования А, С, G и U, но также нескольконеобычных,илиминорных,оснований.Например, в дрожжевой тРНКРhе минорными основаниямиявляютсяпсевдоуридин(обозначаемый Ψ), дигидроуридин (D) иоснование, обозначаемое Y.
Кроме того, внекоторых обычных основаниях один или дваатома водорода могут быть замещены на метильные (СН 3) группы; метилированные илидимети-лированныеоснованияотмечаютсясоответственно с помощью символов m или т 2при букве, обозначающей то или иноеоснование.Клеверный лист — это структурное представлениемолекулы тРНК, полученное из условия образования максимального числа уотсон-криковскихпар оснований при данной нуклеотиднойпоследовательности. Участки, в которых спомощью водородных связей образовалисьтакие пары оснований, называются стеблями, аодноцепочечные участки — петлями.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
