Л.А. Лутова - Генетическая инженерия растений - свершения и надежды (статья) (1117891), страница 3
Текст из файла (страница 3)
В некоторых случаях в одном множественном сайтеимеется 18–20 сайтов, узнаваемых разными рестриктазами, почему эти участки и называются полилинкерами [3].Кроме того, при конструировании векторных молекул должно быть предусмотрено наличие промоторов,работающих в растениях. Промотор (участок, к которому присоединяются РНК-полимеразы) должен обладатьнабором свойств, а именно: силой (активной экспрессией), возможностью регуляции, ткане- и органспецифической экспрессией. Так, например, к регулируемымпромоторам относится промотор генов белков теплового шока (генов, активность которых индуцируется приповышенной температуре), а тканеспецифичная экспрессия характерна для генов, контролирующих синтеззапасных белков, например зеина, который обнаружентолько в тканях семян злаков.
Наиболее популярнымявляется промотор гена вируса мозаики цветной капусты (CAMV). Гены, подшитые к такому промотору, активно экспрессируются во всех тканях [2, 3].Наконец, в векторе должны быть предусмотренымаркеры, с помощью которых возможен отбор трансгенных растений. В литературе маркерные гены ещеназывают репортерными.
Их достаточно много. Например, luxA и luxB – это гены, выделенные из ДНКсветлячков. Они контролируют синтез люциферазы,которая обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в основную, что и обеспечивает свечение. В последнее время пользуется популярностью другой репортерный ген – pgfp, который контролируетсинтез GFP-белка (green fluorescent protein). Этот генбыл выделен из ДНК медузы Acquorea victoria. Трансгенные растения с этим геном светятся в ультрафиолете зеленым светом.Традиционный способ трансформации растительных клеток с помощью Т-ДНК заключается в нанесенииагробактерий, содержащих Ti-плазмиду, на специальноповрежденный побег. Сейчас используют широкий арсенал методов для получения трансгенных растений.Создан даже специальный прибор – “Shotgun”, который стреляет мельчайшими вольфрамовыми пульками, одетыми в молекулы ДНК, осуществляя таким образом трансформацию растительных клеток.ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙС ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Ti-ПЛАЗМИДЕще несколько лет назад ученые задавали вопрос, можно ли создать сорта, сбалансированные по составу аминокислот, устойчивые к холоду, засухе, не поражаемыевредителями.
Сегодня можно с уверенностью утверждать, что такие трансгенные растения уже вышли в поле [6]. По литературным данным, к 1997 году в 30 странах мира проведено более 3 тыс. полевых испытаний. Вэтих экспериментах использовали трансгенные растения 40 различных видов, относящихся к разным семействам, включая злаки [6]. После успешных экспериментов появились опасения о возможном вредегенетической инженерии для природы и человечества.Однако уже более чем за четверть века своего существования генетическая инженерия не принесла ущербани природе, ни человеку.
Главное, в любых экспериментах по генной инженерии следует соблюдать разработанные правила.Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства, таккак болезни растений стали основным лимитирующимфактором получения урожая. В арсенале генной инженерии растений есть много приемов, позволяющих получить трансгенные растения, устойчивые к насекомым.Традиционно используют ген bt, продуктом которогоявляется бактериальный токсин Bacillus thuringiensis.Эта тюрингская бактерия продуцирует крупный белок(протоксин), контролируемый геном bt, который, попадая в кишечник личинок насекомых, разрушаетсяпод действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к их гибели. На рис. 5 приведена схемаконструирования вектора и получения трансгенныхрастений хлопка, которые приобретают признак устойчивости к насекомым. В настоящее время уже синтезирован искусственный ген bt, конструкция с которымболее эффективна, а сами трансгенные растения обладают широким спектром устойчивости к насекомым.Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы сгеном bt уже производятся фирмами “Monsanto”, “CibaSeeds” и продаются на рынках мира, хотя дискуссии обих использовании еще не закончены [6].Известно, что растения, так же как и животные,способны вырабатывать иммунитет.
Этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения,у которых при атаке патогенов сильно меняется метаболизм. Например, у устойчивых растений накапливаются такие химические соединения, как перекись водорода (Н2О2), салициловая кислота (SA), фитоалексины(соединения, выполняющие защитную функцию в растении). Повышенное содержание этих соединенийЛ У Т О В А Л . А . Г Е Н Е Т И Ч Е С К А Я И Н Ж Е Н Е Р И Я РА С Т Е Н И Й : С В Е Р Ш Е Н И Я И Н А Д Е Ж Д Ы15БИОЛОГИЯBacillus thuringiensisКлонированный ген токсина(кодирует 1178 аминокислот)Фрагмент гена,кодирующий454-615 аминокислотCAMV промоторLBТерминаторRBCAMVпромоторТ-ДНКбинарныйвекторПеренос в агробактериюЗаражение проростковТрансгенные растенияхлопка экспрессируютвысокий уровень bt-токсинаbt-Токсин убиваетв листьях личинкиКонтрольный листРис. 5.
Получение трансгенных растений хлопка сгеном bt, несущим устойчивость к насекомым. Ген bt(Bacillus thuringiensis) кодирует 1178 аминокислот илокализован в бактерии на плазмиде. Показано получение фрагмента гена bt, достаточного для устойчивости растений к насекомым.
Дана схема встраивания этого фрагмента в Т-ДНК вектор между LB(левой) и RB (правой) его границами. В векторе былиспользован также удвоенный промотор CAMV, который увеличивал экспрессию bt-гена в пять раз.Растения хлопка были трансформированы этим вектором через агробактериальную инфекцию. Трансгенные растения оказались устойчивыми к личинкам большого числа видов насекомых16способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами. Вот один из примеров, доказывающий рольсалициловой кислоты в иммунном ответе растений.Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилатгидролазы (этот фермент разрушает SA), были неспособны к иммунному ответу.
Поэтому изменение генноинженерным путем уровня салициловой кислоты иливыработки в растениях в ответ на патоген H2O2 можетбыть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с “antisenseRNA” (перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена.В этом случае при конструировании вектора копиюДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на180°. В результате в трансгенном растении образуетсянормальная молекула мРНК и перевернутая, которая всилу комплементарности нормальной мРНК образуетс ней комплекс и закодированный белок не синтезируется [3].
Такой подход использован для получениятрансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы (polygalacturonase) – фермента, участвующего в разрушениипектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томатыстановятся более мягкими, что значительно сокращаетсрок их хранения.
Отключение этого гена в трансгенахпозволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольшесохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Такой же подход можноприменить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используютген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которогоявляется фермент, участвующий в биосинтезе этилена.Этилен – это газообразный гормон, одной из функцийкоторого является контроль за процессом созреванияплодов [5, 7].Таким образом, стратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов.
Эта стратегия используется не толькодля получения растений с новыми качествами, но и дляфундаментальных исследований в генетике растений.Следует упомянуть еще об одном направлении вгенной инженерии растений, которое до недавнеговремени в основном использовали в фундаментальныхисследованиях – для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась вС О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 1 0 , 2 0 0 0БИОЛОГИЯполучении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt и т.д. Эти эксперименты внеслисущественный вклад в доказательство роли ауксинов ицитокининов в дифференцировке растений [4, 5].В последние годы этот подход стали использовать впрактической селекции.
Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то естьсформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствиемсемян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему “лишних косточек”, напримерв арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенныерастения кабачков, которые в целом не отличаются отконтрольных, но практически не содержат семян.Остается добавить несколько слов еще об одномаспекте возможностей использования Ti-плазмиды агробактерии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
