В.М. Глазер - Гомологичная генетическая рекомбинация (статья) (1117837), страница 3
Текст из файла (страница 3)
coliбудет рассмотрен ниже.Модель Холлидея в ее современном виде общепризнана и универсальна для прокариот и эукариот(и для половых, и для соматических клеток). Ее достоинством является тот факт, что она хорошо проверяется генетическими данными, и практическивсе ее этапы постепенно нашли экспериментальноеподтверждение. Полухиазмы Холлидея хорошовидны под электронным микроскопом (см. рис. 4).Обнаружены специальные эндонуклеазы (их называют резолвазами), которые осуществляют разрешение полухиазмы, как это изображено на рис.
3, г.К настоящему времени такие резолвазы обнаружены у бактериофагов T4 и T7, E. coli, дрожжей и человека. У E. coli выявлены также белки, осуществляющие миграцию ветвления полухиазмы. Именно напримере E. coli как наиболее изученного в отношении рекомбинации объекта мы рассмотрим конкретные механизмы кроссинговера.êÖäéåÅàçÄñàü ì E. COLI: ÉÖçÖíàóÖëäàâäéçíêéãú à åéãÖäìãüêçõâ åÖïÄçàáåКлетки E. coli способны к обмену генетической информацией с помощью двух процессов, заменяющих17им половой: конъюгации и трансдукции.
При конъюгации клетки разных половых типов вступают вконтакт, и из клетки донора в клетку реципиентапередается одна из двух цепей кольцевой ДНК (хромосомы или конъюгативной плазмиды, если последняя не интегрирована в хромосоме). При этомконъюгирующие пары бактериальных клеток постепенно расходятся из-за непрочной связи междуними, и перенос ДНК сразу прекращается. Поэтомуреципиентные клетки никогда не получают от донора полную однонитевую кольцевую хромосомную ДНК, а только ее часть, которая сразу достраивается до линейного двуцепочечного фрагмента стак называемыми тупыми концами (у них нет выступающих одноцепочечных концов – “хвостов”).Размеры перенесенных фрагментов варьируют, чаще всего они достигают нескольких сот т.п.н. Притрансдукции из клеток донора в клетку реципиентас помощью бактериофага (бактериального вируса)переносится двуцепочечный фрагмент бактериальной хромосомы, но в десятки раз меньшего размера,чем при конъюгации.
Таким образом, с физическойточки зрения генетический материал, передаваемый реципиентам при конъюгации и трансдукции,отличается только размерами. Далее донорныйфрагмент должен заменить гомологичную частьхромосомы реципиента с помощью парных кроссинговеров, проходящих вблизи концов фрагмента(см. рис. 1, в).Рассмотрим механизм самого кроссинговера уE. coli. На начальной стадии исследований в лаборатории А.
Кларка в США был выделен и изучен набор мутантов с нарушениями рекомбинации (у нихбыла подавлена способность давать рекомбинантное потомство при конъюгации и трансдукции). Спомощью этих мутантов, названных rec, были установлены соответствующие гены, а затем выделенырекомбинационные белки, инактивированные умутантов.Самый главный белок RecA – продукт гена recA.Белок имеет небольшой размер (всего около 38 кД)и проявляет разнообразные активности. Этот белокучаствует не только в рекомбинации, но и в репарации ДНК. Мы рассмотрим только его роль в рекомбинации. В условиях in vitro для проявления всехактивностей белка RecA требуются в качестве кофакторов АТФ и одноцепочечная ДНК в любойформе, например дуплексная ДНК с концевыми(хвосты) или внутренними (бреши) одноцепочечными участками.
Основное назначение белка RecA –приводить во взаимодействие одноцепочечнуюДНК с гомологичным дуплексом. В зависимости отструктуры ДНК-субстратов белок может проводитьразные рекомбинационные реакции. Три из них показаны на рис. 6. Прежде чем рассматривать эти реакции, отметим некоторые общие закономерностифункционирования RecA-белка.Важнейшее свойство белка RecA определяетсяналичием у него двух сайтов связывания с ДНК.18Первый сайт используется для первичного связывания с ДНК: в присутствии АТФ белок всегда взаимодействует в этом сайте с одноцепочечной ДНК.Связывание белка носит кооперативный характер,то есть его молекулы собираются на ДНК по принципу “конец-в-конец”, образуя вокруг ДНК правозакрученную белковую спираль (не надо путать еесо спиралью самой ДНК). В результате возникаетнитевидное образование – RecA-ДНК-филамент.Если одноцепочечная ДНК была в составе двуцепочечной молекулы (как хвост или брешь), то формирование филамента распространяется на дуплекс,что сопровождается гидролизом АТФ.
В филаментедвуцепочечная ДНК изменяет свою конформацию.В отличие от обычной В-формы ДНК (где шаг спирали составляет 10,4 п.н.) на один виток спиралиДНК в филаменте приходятся 18,6 п.н., в результатечего ДНК оказывается растянутой в 1,5 раза. Считается, что такое растяжение дуплекса необходимоа1вб++11+5'223'Миграцияветвления3+3'5'23Рис. 6. Схемы трех рекомбинационных реакций,осуществляемых белком RecA E.coli in vitro (из:Smith G.R.
// Ann. Rev. Genet. 1987. Vol. 21. P. 179–201, с изменениями). Линии соответствуют цепямДНК. Вертикальными черточками на этапе 2 изображены водородные связи. Они даны для выделения участка вновь образованного гетеродуплексав D-петле. RecA-ДНК-филамент на рисунке не показан: а – реакция между кольцевой двуцепочечной ДНК и гомологичной одноцепочечной ДНК.Для эффективной реакции кольцевая ДНК должнабыть сверхспирализована, на рисунке это не показано. Одноцепочечная ДНК внедряется в кольцевой дуплекс в участке, гомологичном ее концу,и образует D-петлю; б – реакция между кольцевойодноцепочечной ДНК и гомологичным линейнымдуплексом. На этапе 2 показаны интермедиат реакции с D-петлей и направление последующеймиграции ветвления, которая приведет к появлению продуктов рекомбинации: кольцевого дуплекса с одноцепочечным разрывом и линейнойодноцепочечной ДНК (этап 3 ); в – рекомбинациямежду гомологичными дуплексами, один из которых имеет одноцепочечный конец.
ОбразованиеD-петли и затем полухиазмы Холлидея (этап 2),миграция полухиазмы влево (этап 3 )ëéêéëéÇëäàâ éÅêÄáéÇÄíÖãúçõâ ÜìêçÄã, ‹7, 1998для его последующего взаимодействия с гомологичной одноцепочечной ДНК. Формирование филамента завершает подготовительную, пресинаптическую стадию кроссинговера.Реакции, составляющие следующую, синаптическую стадию кроссинговера, происходят тольковнутри филаментов. При этом филаменты могутвступать в рекомбинацию только с “голой”, не находящейся в филаменте ДНК. Два филамента не рекомбинируют друг с другом. Взаимодействие филамента с голой ДНК осуществляется за счет второгосайта связывания RecA. Связывание с ДНК во втором сайте слабое.
Из-за этого между филаментом иголой ДНК возникают лишь кратковременные контакты (соударения). Эти контакты становятся прочными только после встречи гомологичных последовательностей.Нахождение гомологии связано с формированием гетеродуплекса. Обычно оно начинается с образования структуры, в которой задействованы трицепи ДНК и которая называется D-петлей (от англ.displacement loop – петля вытеснения). Это происходит следующим образом: одноцепочечная ДНКвнедряется в дуплекс (рис.
6, а) и образует двойнуюспираль (гетеродуплекс) с одной, комплементарнойей цепью дуплекса, одновременно вытесняя вторуюцепь. D-петля может быть закрытой, если в дуплексвнедряется одноцепочечный хвост (рис. 6, а), илиоткрытой, если она формируется на конце линейного дуплекса (рис. 6, б и в).На следующем этапе – постсинапсисе гетеродуплекс удлиняется путем миграции ветвления, которую in vitro также может осуществлять белок RecA.В случае рекомбинации между одноцепочечнойДНК и дуплексом она происходит в определенномнаправлении, полярно, как показано на рис. 6, б.Эта полярность определяется активной (рекомбиногенной) ролью 3'-концевой одноцепочечной ДНКв реакции, катализируемой белком RecA.
Миграцияветвления под действием RecA-белка сопровождается гидролизом АТФ, но происходит медленно, соскоростью несколько п.н./с. Таким образом, в условиях in vitro белок RecA способен осуществлять поиск гомологии, формировать синаптическую структуру на основе гетеродуплекса и производить обменцепями между гомологами.
Эти реакции стимулируются добавлением белка SSB, который выпрямляет одноцепочечную ДНК.Мы рассмотрели реакции, катализируемые белком RecA in vitro. В условиях in vivo, то есть в бактериальной клетке, где вместе с RecA задействованыдругие белки, распределение обязанностей можетбыть несколько иным. Например, в клетке белокRecA не проводит миграцию ветвления. Это болееэффективно делают другие специальные белки.
Надо отметить, что разнообразие белков, работающихвместе с RecA, отражает разнообразие путей рекомбинации. Еще в 1973 году А. Кларк описал у E. coliÉãÄáÖê Ç.å. ÉéåéãéÉàóçÄü ÉÖçÖíàóÖëäÄü êÖäéåÅàçÄñàüтри разных пути гомологичной рекомбинации, нони один из них не функционирует без RecA-белка.А теперь посмотрим, как осуществляется основной путь рекомбинации у E. coli – RecBCD. Главнуюроль здесь играет фермент RecBCD-нуклеаза, субъединицы которой кодируются генами recB, recC иrecD. Фермент проявляет несколько активностейтолько в присутствии АТФ. RecBCD может гидролизовать одно- и двуцепочечную ДНК, притом собоих концов, то есть работать как экзонуклеаза.Он имеет также хеликазную активность, то есть расплетает дуплекс ДНК, затрачивая на это энергиюАТФ.
Наконец, фермент работает как сайт-специфическая эндонуклеаза: расщепляет одноцепочечнуюДНК около особой 8-нуклеотидной последовательности 5'-GCTGGTGG-3', называемой Chi-сайтом.RecBCD-нуклеаза – один из самых ранних белков рекомбинации. Она готовит субстрат для белкаRecA. Напомним, что при конъюгации и трансдукции в реципиентной клетке оказывается линейныйдуплекс донорной ДНК с тупыми концами. Именнотакая ДНК необходима для рекомбинации с реципиентной хромосомой с участием RecBCD.
Нижеприводится схема работы фермента, основанная наэкспериментальных данных и подтвержденная электронно-микроскопическими наблюдениями. Фермент атакует конец дуплекса и начинает расплетатьего (рис. 7, а). Реакция асимметрична, что проявляется в особой роли цепи ДНК с 3'-концом. RecBCDудерживает его таким образом, что образуется одноцепочечная петля примерно в тысячу нуклеотидовдлиной, тогда как 5'-цепь выступает в виде свободного хвоста.
Продолжая расплетать дуплекс, RecBCDнуклеаза сохраняет петлю в 3'-цепи и продвигаетее вдоль дуплекса. Поскольку после прохожденияфермента комплементарные цепи ренатурируют(“схлопываются”), в 5'-цепи автоматически возникает вторая петля (рис. 7, б ). Двойная петля продвигается вдоль дуплекса до тех пор, пока фермент невстретит Chi-сайт в 3'-цепи. Фермент должен подойти к Chi-сайту справа, с 3'-стороны. На расстоянии 4–6 нуклеотидов до него RecBCD разрывает3'-цепь (рис. 7, в) (вспомните о постулированныхХоллидеем особых последовательностях ДНК, в которых происходят первичные разрывы цепей). Дальнейшее расплетание дуплекса приводит к вытеснению рекомбиногенного одноцепочечного 3'-конца(рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
