Структурные изменения хрящевой ткани при неразрушающем лазерном воздействии с длиной волны 1,56 мкм (1105752), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Импрегнация наночастиц магнетитаДля импрегнации использовали водную дисперсию наночастиц магнетитаконцентрацией 0,01 мг/мл, синтезированных в присутствии 0,5% масс. крахмала вкачестве стабилизатора. Образцы суставного и реберного хряща помещали вцилиндрические кюветы, так что границы образцов плотно прилегали к центру кювет,после чего кюветы заполняли дисперсией наночастиц. Время импрегнации составляло20 мин.
Во время импрегнации на кювету с образцом воздействовали постоянныммагнитом с магнитным полем величиной 2000 Гаусс, приложенном в направленииглавной оси цилиндрической кюветы. Образцы суставного и реберного хряща делили на5 экспериментальных групп:(1) Интактные образцы, необлученные и неимпрегнированные наночастицами;(2) Облученные образцы, неимпрегнированные наночастицами;(3) Необлученные образцы, импрегнированные наночастицами;(4) Облученные образцы, импрегнированные наночастицами;(5) Образцы группы (4), подвергнутые после импрегнации повторному лазерномувоздействию в том же режиме.Таким образом, экспериментальные группы (1а – 5а) соответствуют образцамсуставного хряща, а группы (1б – 5б) образцам реберного хряща. После подготовкиобразцов всех экспериментальных групп их делили на две части: первую часть образцов(24 суставных и 12 реберных) фиксировали в 10% формалине для подготовки их кгистологическому и гистохимическом анализу.
Вторую часть образцов (24 суставных и24 реберных) фиксировали в 2,5% р-ре глютарового альдегида для подготовки их канализу ПЭМ.4.1.4. Гистология и гистохимияДля гистологического исследования образцы суставного и реберного хрящафиксировались в 10%-ном нейтральном формалине, заливались в парафин. Срезы 4-5мкмготовились намикротомеиокрашивалисьгематоксилином иэозином,66пикрофуксином по Ван-Гизону на коллагеновые волокна и толуидиновым синим накислые гликозаминогликаны. Полутонкие срезы готовили с помощью ультрамикротомаLKB модель 3 (Швеция). Полутонкие срезы залитых в глютаровый альдегид образцовокрашивались метиленовым синим - азур II с докраской основным фуксином ифотографировались на световом микроскопе.
Срезы просматривались на микроскопеLongway LCX-121S и фотографировались с помощью камеры DEM200 MiniSee(программа обработки Scope Photo).4.1.5. ПЭМДля электронной микроскопии образцы в виде цилиндров размером 1,5 - 2 мм3фиксировались в 2,5% растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере (рН=7,2) ивыдерживались при температуре 40⁰С не менее 24 ч.
После этого ткань отмывали в двухсменахфосфатногобуферапо10-15мин.Обезвоживаниепроводиливпоследовательной смене спиртов повышающейся концентрации: 40⁰ – 10 мин, 50⁰ – 10мин, 70⁰ – 20-30 мин, 96⁰ – две смены по 15 мин, абсолютный спирт – две смены по 15мин.Послеспиртапродолжалиобезвоживаниевацетоне(которыйслужитрастворителем для смолы) с целью дальнейшей пропитки ткани и заливки в смолу –аралдит: смесь абсолютный спирт – абсолютный ацетон (1:1) – 20 мин, абсолютныйацетон – 2 смены по 15 мин.
Пропитку начинали в смеси ацетон-аралдит 1:1,выдерживая в этой смеси 2,5 - 3 часа, продолжали пропитку, переводя кусочки ткани вчистую смолу аралдит на 18-20 часов при комнатной температуре до полного испаренияацетона. После этого для окончательной заливки кусочки помещали на дножелатиновых капсул, заливали свежей порцией смолы и ставили в термостат на 600С на48-60 ч для полимеризации смолы. Далее желатиновую капсулу удаляли кипящей водой.Полученные блоки нарезали на ультрамикротоме.
Срезы, толщиной 20-30 нмрасправляли парами хлороформа на поверхности воды и выкладывали на формваровуюподложку в центр медной бленды. Срезы окрашивали уранилацетатом.Электронные микрофотографии получали на просвечивающем электронноммикроскопе Jeol JEM-1011 при величине ускоряющего напряжения 80 кВ.4.1.6. АСМДля атомно-силовой микроскопии готовили срезы хрящевой ткани толщиной 20мкм на криотоме Leica 3050 S, которые расправляли на предметных стеклах. Срезыанализировали на атомно-силовом микроскопе Nanoscope IIIa (Digital Instruments, Santa67Barbara, USA). Высотные профили получали на воздухе при комнатной температуре спомощью сканирующего зонда из нитрида кремния в бесконтактном режиме причастоте сканирования 1,5 Гц и резонансной частоте 2,0 В. Данные анализировались впрограмме Gwyddion 2.03.4.1.7.
Измерение пропускания ИК излученияАнализ проводили на установке, снабженной детектором прошедшего ИКизлучения, тепловизором Testo, расположенным под углом 30⁰ к направлению лазерноголуча, и системой позиционирования образца. Воздействие на образцы хряща толщиной1 мм осуществляли эрбиевым волоконным лазером с длиной волны 1,56 мкм («ИРЭ –Полюс», модель ЛС-1.56, Россия) через волокно диаметром 600 мкм в непрерывномрежиме (1 Вт, 50 сек). Образец находился на расстоянии 5 мм от излучающего волокна ина 10 мм перед принимающим волокном. Данному анализу подвергали (1) и (4) сериюобразцов:(1) Интактные образцы, необлученные и неимпрегнированные наночастицами;(4) Облученные образцы, импрегнированные наночастицами.4.2. Общее описание структурыВ эксперименте, рассматриваемом в настоящей главе, лазерное воздействиеосуществляли через волокно диаметром 600 мкм, что позволяет локализовать областьлазерно-индуцированных структурных изменений в небольшом объеме ткани, а такжевыделять центр пятна облучения с достаточно большой точностью.
Гистологическийанализ структуры матрикса позволяет выделять и исследовать секции ткани толщинойнесколько мкм, непосредственно прилегающих к центру пятна облучения. При этом схорошим разрешением могут быть исследованы области ткани в несколько десятковмикрометров.Контрольные образцы суставного хряща в левом и правом суставах, изученные впарафиновых срезах при окрасках гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ВанГизону и толуидиновым синим, а также в полутонких срезах показали, что общаяструктурахрящевойтканисоответствуетнормальномугиалиновомухрящу.Поверхностная блестящая пластинка, поверхностный, промежуточный и глубокий слоиимеют обычные для суставного хряща соотношение хондроцитов разных форм иструктуру матрикса, состоящего из коллагеновых структур и протеогликанов.Полутонкие срезы, в отличие от парафиновых, дают возможность изучения цитоплазмы68хондроцитов, а также хондронной структуры, проявляющейся в менее интенсивномокрашивании территориального матрикса по сравнению с межтерриториальным(Рис.24).
Клетки имеют ядра округлой, либо удлиненной формы, светлую цитоплазму ичеткую лакуну (зону территориального матрикса).Рисунок 24. Полутонкий гистологический срез ткани суставного хряща, окраска азур II,увеличение х400. Хондроциты глубокого слоя с четкими ядрами, цитоплазмой и лакунами, безпризнаков деструкции ядер.В глубоком слое образцов хряща вблизи поверхности разреза выявляетсянебольшое количество дистрофически измененных хондроцитов, что объясняетсямеханическим воздействием разрезания ткани (Рис.25). Количество таких измененныхклеток колеблется от 5 до 8%. Различия между правым и левым суставом выявлены небыли.
Контрольные образцы реберного хряща, как и в суставном хряще, состоят из трехслоевгиалиновогохряща.Отличиязаключаютсяв1)наличиифибрознойсоединительно-тканной надхрящницы (Рис.25(Б-2), Рис.26), 2) глубоких инвагинацийрыхлой соединительной ткани с сосудами вглубь хряща, что необходимо для улучшенияпитания толстого хряща, 3) значительно большего содержания хондроцитов и меньшегообъема матрикса, 4) более четко различимы границы околоклеточного и межклеточногоматрикса (Рис.25(Б-2)).
Дистрофически измененные клетки видны только вблизи среза иони единичны (до 5%).69Рисунок 25. Гистологические срезы интактной ткани, окраска гематоксилином иэозином: (А-1), увеличение х200 – суставной хрящ, глубокий слой, граница соответствуетповерхности среза. Относительно многочисленные хондроциты, в том числе двуядерные,дистрофические изменения минимальны.
(А-2), увеличение х100 – суставной хрящ,поверхностный и средний слой, граница соответствует блестящей пластинке. Неравномерностьокрашивания матрикса свидетельствует о его более рыхлой структуре, чем в глубоком слое, (Б1), увеличение х200 – реберный хрящ, глубокий слой, граница соответствует поверхности среза.Хондроциты с четкими лакунами, дистрофические изменения единичны. Участок инвагинациисоединительной ткани выделен черной пунктирной линией. (Б-2), увеличение х100, окраскапикрофуксином – реберный хрящ, поверхностный и средний слой, граница соответствуетнадхрящнице.
Средний слой представлен хонроцитами большего размера, среди которыхвыявляются небольшие изогенные группы (клоны), состоящие из двух и реже из трех клеток.Видны четкие границы между территориальным (околоклеточным) и межтерриториальнымматриксом.Таким образом, процедура разрезания и механического воздействия на образцы впроцессе их подготовки не приводит к существенному повреждению клеток и матрикса.70Рисунок 26. Полутонкий гистологический срез ткани реберного хряща, окраска азур II,увеличение х200. Граница поверхностного слоя хряща с надхрящницей: вверху хондроцитыхряща, внизу коллагеновые пучки и фибробласты надхрящницы.ПрианализесрезовинтактногосуставногохрящаспомощьюПЭМобнаруживаются хондроциты с плотным, часто эксцентрично лежащим ядром ицитоплазмой,имеющейцитоплазматическиевыросты,гранулярныйэндоплазматический ретикулум (ГЭР), липидные включения (Л) (Рис.27(А-1)).Территориальный и межтерриториальный матрикс состоит из сети разнонаправленныхколлагеновых фибрилл диаметром от 15 до 35 нм с типичной поперечнойисчерченностью (ок.
64 нм), а также мелкогранулярного и тонковолокнистого веществапротеогликанов. Редко встречаются коллагеновые фибриллы диаметром до 100 нм(Рис.27(А-2)).Как и в суставном хряще, при электронно-микроскопическом исследованииинтактного реберного хряща обнаруживаются хондроциты и межклеточный матрикс.Некоторым отличием от суставного хряща является то, что вокруг клетки относительночетко видно резко разрыхленный матрикс, по-видимому, являющийся лакунойхондроцитов (Рис.27(Б-1)).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
