Диссертация (1104775), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Оптические волокна показали себя идеальным кандидатом на эту роль, позволив осуществлять измерения, которые невозможны без ихприменения – например, исследование нейронной активности живых свободноподвижных животных.Впервые миниатюризированный микроскоп для изучения тканей мозга живых животных был продемонстрирован в пионерской работе группы Денка в 2001году [42].
Ключевым элементом являлось одномодовое волокно, которое осуществляло доставку фемтосекундного излучения накачки до оптики, смонтированной на голове животного. Стандартные одномодовые волокна со ступенчатоизменяющимся профилем показателя преломления хорошо подходят для доставки непрерывного излучения накачки в системы визуализации, так как одна пространственная мода может быть сфокусирована близко к дифракционному пределу, позволяя тем самым осуществлять оптическую визуализацию с высокимпространственным разрешением [43]. Однако, доставка коротких импульсов вызывает ряд трудностей.Новое поколение волоконных миниатюрных двухфотонных микроскоповбыло продемонстрировано в 2009 г. в работе [44].
Для доставки возбуждающего излучения использовалось одномодовое сохраняющее поляризацию волокно,чтобы избежать изменений в поляризации излучения накачки, вызванных движением крысы. Для сбора флуоресцентного отклика использовалось многомодовое волокно. Многомодовые волокна хорошо подходят для сбора некогерентного флуоресцентного отклика за счет большего диаметра сердцевины и большейчисловой апертуры. Флуоресцентный сигнал и сигнал спонтанного комбинационного рассеяния, волоконно-оптическая регистрация которых востребована вомногих приложениях in vivo визуализации активности нейронов, представляют25собой некогерентный отклик, зачастую ещё и рассеянный в тканях мозга. Некогерентное излучение обладает низкой плотностью пространственных мод, что непозволяет осуществлять его эффективный сбор одномодовым волокном, по которому осуществлялась накачка [45].В отдельный подкласс многомодовых волокон, использующихся в задачахбиофотоники, можно выделить градиентные волокна, в которых показатель преломления сердцевины ncore в общем случае уменьшается квадратично с увеличением расстояния до центральной оси: ncore (r) = n0 (1 − g 2 r2 /2).
В отличие отмногомодовых волокон со ступенчато изменяющимся профилем показателя преломления, в градиентных волокнах различные пространственные моды, формирующие изображение, распространяются практически с одинаковой скоростью.Это значит, что, при правильном подборе длины, подобные градиентные волокна могут быть эффективно использованы в качестве линз [46]. При этом числораспространяющихся пространственных мод в градиентной среде ограничиваетоптическое разрешение передаваемого изображения. Это свойство градиентныхволокон широко используется в случае необходимости миниатюризировать фокусирующую оптику для in vivo приложений. Хотя разработано много вариантовминиатюрных объективов с высокой числовой апертурой (NA = 0.46-1.0) их размер достаточно большой для эндоскопических in vivo приложений и составляетоколо 3-7 мм в диаметре [47].
Создание минимально инвазивной фокусирующейоптики стало возможным только с развитием и изготовлением градиентных волокон и микролинз [48—50]. Размер градиентных микролинз, использующихся приисследованиях мозга, обычно составляет 1 мм, что заметно меньше стандартнойфокусирующей оптики, но все еще не позволяет проводить исследования глубоких слоев без удаления коры.Волоконно-оптическая эндоскопия является минимально инвазивным способом изучать функциональную активность глубоколежащих структур мозга.
Было показано, что в качестве высокоапертурной линзы можно использовать многомодовое волокно со ступенчато изменяющимся профилем показателя преломления путем управления фазой различных волноводных мод. Было разработанонесколько способов заранее фазировать излучение, заводимое в волокно для эффективной фокусировки [28–30] и продемонстрирована перспективность этогонаправления для задач биофотоники [51; 52]. Была продемонстрирована возможность визуализации нейронов с помощью разработанных методов контроля фазыразличных мод волокна [53]. Волоконно-оптической формат микроэндоскопии на26базе многомодовых волокон обладает фундаментально минимальными размерами зонда и пригоден для построения трехмерных изображений флуоресцентныхобъектов. Поперечное пространственное разрешение таких методик практическидостигает дифракционного предела для числовой апертуры зонда.
Но, к сожалению, в настоящий момент реализованные методики обладают рядом фундаментальных недостатков. Основная проблема – это неустойчивость к изгибам волокна, что пока не позаоляет применение на бодрствующих животных. Продемонстрированные значения возможного изгиба без потери качества изображения соответствуют латеральному смещению выходного торца волоконного зонда толькодо 1 см при длине отрезка 30 см [54].Использование вживлённых отдельных многомодовых волокон также широко практикуется в задачах оптогенетики [55], когда волокно используется только для возбуждения специально подготовленных нейрональных клеток, экспрессирующих светочувствительные каналы, например, каналродапсин-2, в выбранной области мозга живого животного без считывания какого-либо оптическогоотклика [56; 57]. Волоконно-оптические зонды на базе пучков волокон также находят свое широкое применение в клинических приложениях [58—62].Однако проведение долговременных исследований все еще довольно затруднительно, так как вживленный оптоволоконный зонд легко может быть поврежден грызуном и постоянно требует повышенного внимания.
Следовательно,при долговременных измерениях возникает существенная необходимость содержать мышей в особых условиях и отдельно следить за ними, не говоря о том,что постоянное присутствие длинного оптоволокна на голове, несмотря на низкийвес, может мешать животному и нарушать некоторые формы поведения. Универсальное решение этой проблемы было продемонстрировано в работе [63] на примере регистрации экспрессии немедленно раннего гена zif268 в коре и гиппокампесвободноподвижных мышей на протяжении длительного времени (больше месяца). Для долговременного удобного и минимально инвазивного зондирования былразработан специальный коннектор и двухэтапный метод крепления оптоволокна, обеспечивший возможности проводить долговременный ряд экспериментовна одном и том же животном в любой структуре мозга и при этом сохранять уверенность в получении сигнала от одной и той же группы клеток.Как уже было сказано, волоконно-оптическая передача излучения накачкистановится гораздо более сложной, если требуется осуществить доставку коротких лазерных импульсов, необходимых для эффективного двухфотонного возбуж-27дения.
В случае использования непрерывных источников лазерного излучения вероятность двухфотонного поглощения очень низка из-за квадратичной зависимости от интенсивности и эффективное двухфотонное возбуждение при умереннойсредней мощности обычно достигается путем использования очень коротких лазерных импульсов [64]. Однако, распространение таких импульсов по стандартным кварцевым волокнам приводит к значительному увеличению длительности.Уширение вследствие нелинейно-оптических эффектов особенно сильно проявляется в одномодовых волокнах, так как в сердцевине небольшого размера достигается максимальная интенсивность излучения накачки. Увеличение диаметрасердцевины ведет к уменьшению интенсивности, но, как следствие, теряется одномодовый режим распространения излучения, необходимый для визуализации свысоким пространственным разрешением.
Решением этой проблемы могут служить микроструктурированные волокна с правильно подобранной дисперсией,микроструктурированные волокна с большой площадью моды и полые фотоннокристаллические волокна.Идеология микроструктурированных волокон позволяет объединять разныеволноводные свойства и компоненты в одном волокне [65]. Так, для разработкинового класса оптических сенсоров значительный интерес представляют волокнас двойной МС-оболочкой. В случае регистрации флуоресценции, возбуждающееи собираемое излучение очевидным образом отличаются по своим когерентнымсвойствам.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
