Автореферат (1104485), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Плотность ЛПНП после ишемии меньше плотности контрольныхздоровых ЛПНП. Увеличение размеров ЛПНП и уменьшение их плотностипосле ишемии по сравнению с контрольными здоровыми ЛПНП объясняетсяразрыхлением фосфолипидного амфипатического слоя ЛПНП под действиемсвободнорадикальных продуктов, появляющихся вследствие ишемии.5. Интенсивность люминесценции сыворотки крови животных после ишемиисильно возрастает по сравнению с интенсивностью люминесценции здоровойсыворотки крови. Увеличение интенсивности люминесценции сыворотки кровипослеишемииголовногомозгаоднозначноотражаетповышеннуюконцентрацию свободнорадикальных липидных соединений в фосфолипидномслое постишемических ЛПНП. Добавление флуоресцентных зондов (родамина6Ж, нильского синего) в сыворотку крови подтверждает различие физико8химических свойств ЛПНП сыворотки крови животных до и послеишемической процедуры.Апробация работы. Основные результаты диссертационной работыбыли представлены на следующих конференциях:1.
Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальнымнаукам «Ломоносов-2004» (Москва, Россия, 2004 г.);2. III Международная конференция молодых ученых и специалистов «Оптика2003» (Санкт-Петербург, Россия, 2003 г.);3. Международная конференция «Advanced Laser Technologies-ALT’04» (Рим,Фраскати, Италия, 2004 г.);4. XI Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярныхсистем – Яльчик - 2004» (Яльчик, Россия, 2004 г.);5. III Международная конференция «Фундаментальные проблемы оптики-2004»(Санкт-Петербург, Россия, 2004 г.).Публикации: по материалам диссертации опубликовано 10 печатныхработ.Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, пятиглав, выводов и списка цитируемой литературы.
Работа изложена на 184страницах, содержит 42 рисунка, 6 таблиц и список цитируемой литературы из200 наименований.Во введении рассматривается актуальность поставленных задач иобсуждаются цели настоящей работы.Первая глава, состоящая из шести параграфов, посвящена обзорулитературы, относящейся к исследованию биологических макромолекул спомощью оптических методов (динамического и статического светорассеяния,комбинационного рассеяния света, люминесцентного анализа).9Втораяглавапосвященаметодическойчастиэкспериментов:представлены методики приготовления биологических образцов,описаныэкспериментальные методы исследования.В главах с третьей по пятую представлены и обсуждены полученныеэкспериментальные результаты.В заключение отдельным пунктом вынесены основные результаты ивыводы работы.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВо введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель изадачи исследований, показана новизна и научно-практическая значимостьрезультатов, изложены основные защищаемые положения диссертации.Глава 1, состоящая из шести параграфов, посвящена описанию строениябелковых молекул (§1.1.), описанию состава плазмы (сыворотки) крови высшихмлекопитающих и функций основных её компонентов (§1.2.), обзорулитературы, относящейся к исследованию биологических макромолекул спомощью оптических методов: динамического (§1.3.) и статического (§1.4.)светорассеяния, комбинационного рассеяния света (§1.5.), люминесцентногоанализа (§1.6.).Глава 2 посвящена методической части экспериментов: представленыметодики приготовления биологических образцов (растворы сывороточногоальбуминачеловека,растворысывороткиишемической процедуры) (§2.1.),исследования:динамическоеикровиживотных,описаниеописаны экспериментальные методыстатическоесветорассеяние(§2.2.),комбинационное рассеяние света (§2.3.), люминесцентно-спектральный анализ(§2.4.).10Глава 3 посвящена исследованию агрегации молекул сывороточногоальбумина человека в присутствии соли тяжелого металла (хлорида цезияCsCl) методами лазерной спектроскопии.В параграфе §3.1.
представлены результаты исследований методомлазерной корреляционной спектроскопии рассеянного света размера, формымолекул сывороточного альбумина человека при его агрегации в присутствиисоли тяжелого металла в зависимости от pH буферных растворов белка иконцентрации соли (хлорид цезия CsCl).На основании полученных данных заключено, что белковые агрегаты,образующиеся в присутствии хлорида цезия, имеют практически сферическуюформу. В отсутствие CsCl в буферных растворах белковые молекулы невзаимодействуют друг с другом и имеют форму эллипсоидов вращения.Полученазависимостьгидродинамическогобелковыхрадиусакомплексовконцентрациихлоридаотцезияпри различных значениях pHбуферногораствора(рис.1).Видно, что гидродинамическийрадиусчастицрассеивающихвозрастаетсветпрямопропорционально концентрациихлорида цезия (CsCl), что свидетельствует о слипании молекул альбумина вбелковые агрегаты. Для каждой концентрации CsCl гидродинамический радиусагрегатов максимален при pH 5,0 (вблизи изоэлектрической точки альбумина).Впараграфеаминокислотного§3.2.механизмапредставленыагрегациирезультатысывороточногоисследованияальбуминаприсутствии CsCl методом спектроскопии комбинационного рассеяния света.11вИз сравнения полученных КР - спектрограмм буферных растворовальбумина (до и после добавления CsCl) видно, что наибольшее количествоагрегационных химических связей разных типов между аминокислотнымиостатками возникает при добавлении соли при значении pH 5,0 буферногораствора, т.е.
при наиболее близком к изоэлектрической точке (pI) альбуминазначении pH раствора. При pH 5,0 происходит разрыв наибольшего количествахимических связей между аминокислотными радикалами по сравнению сдругиминеизоэлектрическимизначениямиpH.Наибольшаяагрегацияальбумина имеет место вблизи его изоэлектрической точки, т.е. при pH 5,0.Глава 4 посвящена исследованию ДСН – вызванной и тепловойденатурациисывороточногоальбуминачеловекаметодомкорреляционной спектроскопии рассеянного света.В параграфе §4.1.
представлены результаты исследований (проведенных спомощьюметодалазернойкорреляционной спектроскопииквазиупруго рассеянного света)размера,формымолекулсывороточногокровиальбуминачеловекаприденатурации под воздействиемденатурирующего агента ДСН(додецилсульфата натрия) приразличныхрастворов.значенияхpHЗависимостьгидродинамического радиуса молекул альбумина от концентрации ДСН ивеличины pH буферного раствора представлена на рис.2.Из рис.2 видно, что происходит увеличение размера белка (т.е. егоденатурация) при увеличении концентрации ДСН до значения 7 мМ, после12которого, несмотря на дальнейшее добавление ДСН, размер белка остаётсянеизменной величиной. Т.е. при достижении данной (7мМ) концентрациидетергента происходит насыщение «посадочных» для мицелл детергента местна белке.
Как следует из рис.2, ДСН, как отрицательно заряженный детергент,лучше связывается с белком при значениях pH буферного раствора, меньшихвеличины изоэлектрической точки альбумина (pI 4,7), то есть в той области pH,в которой белок заряжен положительно. Следовательно, большая денатурациябелка в присутствии ДСН имеет место при значениях pH раствора, меньшихизоэлектрической точки альбумина.В параграфе §4.2. методом лазерной корреляционной спектроскопиирассеянного света изучена тепловая денатурация сывороточного альбуминачеловека при различных значениях pH раствора.Показано, что до температуры, равной 450С, гидродинамический радиусмолекул альбумина практически не меняется.
Увеличение размера белковыхмолекул начинается при температуре свыше 450С (в области температур 450С480С происходит денатурация белка). Показано, что денатурация молекулальбумина происходит сильнее при pH, лежащих ближе к изоэлектрическойточке этого белка (pI 4,7). Чем больше значение pH раствора удалено отизоэлектрической точки, тем денатурация белка происходит слабее.Глава 5 посвящена исследованию повреждающего действия ишемии накомпоненты сыворотки крови животных оптико – спектральнымиметодами.В параграфе §5.1.
представлены результаты исследований с помощьюметода лазерной корреляционной спектроскопии квазиупруго рассеянногосвета размеров, формы компонентов сыворотки крови животных и влияния наних ишемического воздействия. При исследовании влияния ишемии головногомозга на сыворотку крови крыс были обнаружены изменения в зоне,соответствующей по диаметру липопротеинам низкой плотности (ЛПНП).13С помощью метода динамического рассеяния света зарегистрировано, чторазмер ЛПНП сыворотки животных после ишемии головного мозга большеразмера ЛПНП здоровой сыворотки примерно на 20-30% для различныхзначений pH буферного раствора разведения сыворотки.Согласно литературным данным, здоровые ЛПНП представляют собойсферическиечастицы.ДляопределенияформыЛПНП ишемическойсыворотки при разных значениях pH были получены зависимости диффузногоуширения Γ от квадрата синуса половины угла рассеяния sin2(θ/2).
Диффузноеуширение спектра рассеянного света для ЛПНП ишемической сывороткилинейно зависит от квадрата синуса половины угла рассеяния, следовательно,несмотря на увеличение радиуса ЛПНП вследствие ишемии их форма остаетсясферической.В параграфе §5.2. представлены исследования (методом статическогорэлеевского рассеяния света) по определению молекулярной массы и плотностиЛПНП. Была получена масса ЛПНП, равная 2,5 млнДа при всех значениях pH,одинаковая для обеих групп (до и после ишемии) животных. Были рассчитанызначения плотности контрольных ЛПНП и ЛПНП сыворотки после ишемии приразличных значениях pH.
При увеличении размеров ЛПНП ишемическойсыворотки относительно размеров ЛПНП здоровой сыворотки происходитуменьшение плотности ишемических ЛПНП по сравнению с плотностьюздоровых ЛПНП в 1,75-2,30 раз.ЗарегистрированныеизмененияЛПНП,произошедшиевследствиеишемии головного мозга, объясняются в рамках свободнорадикальной теорииокислительного стресса разрыхлением фосфолипидного амфипатического слояЛПНПподдействиемсвободнорадикальныхпродуктов,появившихсявследствие ишемии.В параграфе §5.3. представлено исследование повреждающего действияишемиинакомпонентысыворотки14кровиметодомспектроскопиикомбинационного рассеяния света, т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
